梁祥森　甘耐炎　吕凯

摘要：目的 初步探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中SP70抗原表达的临床意义。方法 采用RT-PCR法检测40例肺癌组织（NSCLC 32例，小细胞肺癌8例）和20例肺良性病变组织中SP70抗原表达的相对水平，半定量分析其临床意义。结果 肺癌组SP70平均表达水平明显高于肺良性病变组（P<0.05）；NSCLC组（n=32）SP70平均表达水平高于小细胞肺癌组（n=8）（P<0.05）；SP70的表达水平与患者性别、年龄、淋巴结转移情况、肿瘤临床分期均无关（P均>0.05）。结论 SP70可能是评价NSCLC的一个潜在的指标。

关键词：SP70抗原；非小细胞肺癌；RT-PCR

Abstract：Objective To investigate the non-small cell lung cancer（NSCLC） clinical significance of expression of SP70 antigen in tissues.Methods RT-PCR method was used to detect 40 cases of lung cancer（32 cases，NSCLC 8 cases of small cell lung cancer） relative to the level of expression of SP70 antigen and 20 cases of benign lung lesion，semi quantitative analysis and its clinical significance.Results The mean level of SP70 in lung cancer group was significantly higher than that in benign lung disease group （P<0.05）；NSCLC group （n=32） higher than the mean level of SP70 in small cell lung cancer group[（n=8）（P<0.05）；the expression level of SP70 in patients with gender，age，lymph node metastasis，clinical stage of tumor were independent （P >0.05）.Conclusion SP70 may be a potential indicator of NSCLC.

Key words：SP70 antigen；Non small cell lung cancer；RT-PCR

非小細胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的80%，其死因大多是由于肺癌早期诊断率低且预后差[1]，寻求肺癌早期检测指标及方法成为目前研究热点。近年来，潘世扬等[2-3]研究发现一株能特异性识别NSCLC的McAbNJ00l，此抗体对NSCLC的免疫性诊断和治疗意义重大，其所针对的靶抗原为相对分子质量70000的胞浆新抗原SP70，SP70与NSCLC关系密切。本实验采用RT-PCR法检测40例NSCLC组织和15例良性病变肺组织中SP70的表达水平，分析其表达与临床特征的关系，评价其在临床诊治中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 取我院2014年3月～2015年3月手术切除的未经放化疗的肺肿瘤标本40例，另取20例手术切除的肺良性病变组织作为对照，全部标本均有病理确诊，收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。引物由北京诺赛基因公司设计并合成，目的基因SP70 F：5′-CCAGTTCAAGTGCTCGGCAT-3′；R：5′-TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3′。内参β-actin F：5′GTGACGTTGACATCCGTAAAGACC-3′；R：5′-CTAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。

1.2实验方法 按Trizol裂解抽提法进行总RNA的提取。常规检测RNA的浓度、纯度及完整性。按逆转录试剂盒提供的方法合成cDNA存放-20℃冰箱备用。25μl RT-PCR扩增体系：PCR reaction mixture 12.5 μl，上、下游引物（10 pmol/μl）各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10.5 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30个循环，每份样本重复3次。

1.3统计学方法 用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析。统计数据采用灰度值表示，以β-actin灰度值为参照，标化计算各样本数据，从而获得SP70的相对模板数，即：SP70/β-actin。计量资料采用（x±s）表示，两样本均数的比较采用t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1目的片段 将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析证实PCR产物长度与目标基因SP70长度一致，最后经测序确认为目的产物，如图1。

2.2 SP70的表达比较 肺癌组SP70平均表达水平明显高于肺良性病变组，差异有统计学意义（P<0.05）；NSCLC组（n=32）SP70平均表达水平高于小细胞肺癌组（n=8），差异有统计学意义（P<0.05）；SP70的表达水平与患者性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤临床分期均无关，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

相关研究[2-4]指出SP70是一种针对NSCLC的特异性蛋白靶标，其存在于癌细胞的胞膜和胞浆，可促进癌细胞增殖，是肺癌检测诊断的分子靶标，同时也是抗肺癌治疗靶点，SP70对于肺癌的诊治意义重大。彭蘡[4]等采用ELISA方法检测NSCLC患者中外周血液中SP70的表达，结果发现NSCLC组SP70阳性率明显高于对照组，提示SP70可能是诊断NSCLC的潜在血清肿瘤标志物。亦有研究[5-7]发现恶性胸腔积液中SP70的检出率明显增高，而且NSCLC患者胸腔积液中SP70检出率高于小细胞肺癌。截止目前，对肺癌组织中SP70表达水平的相关研究尚未有报道，本实验直接提取肺癌组织，采用RT-PCR法检测肺癌组织中SP70的mRNA水平，基因层面对SP70基因进行研究，对mRNA的检测可以提高实验数据的准确性，从而进一步证实SP70与NSCLC发生的关系及其与临床组织病理学特征的关系。

本研究发现肺癌组SP70平均表达水平明显高于肺良性病变组（P<0.05），NSCLC组平均表达水平又高于小细胞肺癌组，与相关研究[4]结论一致，进一步证实了SP70与NSCLC的密切关系，提示SP70可能是诊断NSCLC的潜在指标。本实验中内参β-actin在各检测样本中均为阳性表达，证明样本质量良好，实验数据可靠。本实验利用内参对实验数据经过标化处理后再进行统计分析，校正了各样品之间RNA的质量和逆转录效率的差异，使实验结果更加真实可靠，由此得出的结论更加接近实际。但是，多数基因是通过蛋白的表达来发挥作用，本实验检测的mRNA基于基因水平，从mRNA到蛋白中间翻译、修饰过程中可能存在mRNA/蛋白水平倒置现象[8]，需后续试验进一步验证。另外，SP70抗原在胞浆中和胞膜上均有表达，胞浆中表达量更丰富，抗癌药物的作用靶点更为广泛，其潜在临床意义重大，但其抑癌作用机制，仍有待于进一步研究探讨。

参考文献：

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[2]Pan S，Wang F，Huang P，et al.The study on newly developed McAb NJ001 specific to non-small cell lung cancer and its biological characteristics[J].Plos One，2012，7（3）：e33009.

[3]徐婷，潘世扬，王芳.抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的制备及鉴定[J].临床检验杂志，2011，3：216-218.

[4]彭蘡，潘世扬，王芳，等.非小细胞肺癌患者血清中SP70的检测及其临床意义[J].中华检验医学杂志，2012，35（6）：554-558.

[5]邓石雄，刘映云，李尔凡，等.SP70检测在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值[J].中国实验诊断学，2014，（5）：746-748.

[6]張丹华.SP70抗原在癌性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值[J].医学综述，2015（10）：1865-1866.

[7]杨瑞霞，潘世扬，王芳，等.良恶性胸腔积液鉴别中SP70检测的临床意义[J].中华检验医学杂志，2012，35（12）：1150-1154.

[8]陈铭伍，梁祥森，冼磊，等.非小细胞肺癌中MTA1基因的表达及意义[J].江苏医药，2012，38（15）：1761-1763.

编辑/杨倩