张敏 王前英 李昕 胡芸文 施碧胜

201508 上海市公共卫生临床中心医学检验科(张敏、王前英、李昕、胡芸文)；科学研究部(施碧胜)

HIV感染者目前多采取高效抗逆转录病毒治疗，该方案可快速降低患者体内病毒载量，但不能彻底清除病毒，主要原因在于病毒潜伏库的存在[1-2]。一旦停止用药，潜伏库的病毒将会再次复制扩增，导致体内病毒载量迅速反弹[3]。目前针对于潜伏库清除的干预治疗也即针对于潜伏库的清除，如基因修饰技术、基因打靶技术等，但如何评价这些干预措施的有效性便成为临床检测急需解决的问题[4-5]。潜伏库中整合型HIV DNA是主要的存在形式，本实验建立外周血单核细胞整合型HIV DNA荧光定量ALu-PCR的检测方法，以期为临床药物的效果评价和完全治愈提供一定的判定依据[6]。

1 对象与方法

1.1研究对象与样本来源选择2015年至2016年在上海市公共卫生临床中心就诊的HIV患者30例。其中病毒载量<20IU/ml的患者10例，耐药患者10例，初诊患者10例。排除乙肝、丙肝共感染病例。抽取患者静脉血，EDTA抗凝血5 ml。采用Qiagen Whole Blood Kit(德国Qiagen公司)提取样本基因组。罗氏的Cobas AmpliPrep/ Taqman480测定HIV的病毒载量。用ABI7500和GeneAmp PCR system 9700(美国Applied Biosystem公司)进行荧光定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)研究对象均已告知研究内容并签署知情同意书。并通过上海公共卫生临检中心伦理委员会批准。

1.2标准品的制备(1)ACH2细胞系ACH2细胞培养后收集细胞，提取基因组。用无菌TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH=8.0)1∶5进行梯度稀释，共8个梯度。(2)CD3标准品：使用HCD3OUT5(ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG)和HCD3OUT3(CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT)为引物，健康人外周血单个核细胞基因组为模板进行PCR扩增，纯化产物后克隆至pMD19T载体中。提取质粒，Nanodrop 1 000测定其浓度，计算CD3拷贝数。

1.3分离患者白细胞并提取基因组将患者EDTA抗凝血5 ml样本1 100×g离心10 min，吸取白细胞层至一新的离心管，加2 ml生理盐水并颠倒混匀，1 100×g 离心10 min，弃上清，即得到白细胞。对白细胞进行基因组提取。

1.4预扩增样本及ACH2基因组基因组模板1 μl。25 μl 的反应体系，引物ULF1(ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TDG TTA GAC)150 nmol/L，引物ALu1(TCC CAG CTA CTG GGG AGG CTG AGG)及引物ALu2(GCC TCC CAA AGT GCT GGG ATT ACA G)各300 nmol/L，2.5U TaKaRa La Taq 长片段PCR扩增酶，1X扩增酶反应液(含Mg2+)。扩增的反应条件为：95℃8 min； 95 ℃ 1 min，55℃1 min，72 ℃ 10 min，共12个反应循环；72℃15 min。

1.5荧光定量PCR(1)预扩增产物0.5 μl作为模板，进行整合型HIV DNA荧光PCR。20 μl 的反应体系。引物Lambda T(ATG CCA CGT AAG CGA AAC T)300 nmol/L，UR2(CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC)300 nmol/L,探针HIV TaqMan(LC640-CAC TCA AGG CAA GCT TTA TTG AGG C-BBQ)50 nmol/L, TakaRa probe qPCR mix。(2)预扩增产物0.5 μl作为模板，使用1∶5梯度稀释后的pMD19T-CD3质粒作为标准品，进行CD3荧光PCR。反应体系为20 μl。引物CD3IN5(GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T)和CD3IN3(CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A)各300 nmol/L，CD3 Taqman(LC640-AGC AGA GAA CAG TTA AGA GCC TCC AT-BBQ)100 nmol/L，TaKaRa probe qPCR mix。扩增的反应条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s共40个反应循环，在60 ℃退火/延伸步骤收集荧光信号。

1.6统计学方法GraphPad Prism 5软件，进行线性回归分析，采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

表1 3组患者的CD3细胞数及对应的Ct值

表2 3组患者的整合型HIV DNA拷贝数及对应的Ct值

2.2样本及ACH2的细胞数pMD19T-CD3质粒作为标准品进行标准曲线绘制，以Ct作为纵坐标、log10拷贝作为横坐标。计算所得回归曲线的方程为y=-2.731x+43.01(R2=0.953)。由于每个细胞中含有2个CD3基因，因此根据此方程计算可得

到3组患者的CD3细胞数。结果如表1所示：

2.3样本中整合型HIVDNA的拷贝数根据上述结果得到的ACH2细胞数即为HIV-1拷贝数为4.271×104，使用1∶5梯度稀释后的ACH2基因组作为标准品进行标准曲线绘制，以Ct作为纵坐标、log10拷贝作为横坐标。计算得回归曲线的方程为y=-3.146x+39.11(R2=0.968)。根据不同患者的Ct值，计算样本的整合型HIV DNA。结果如表2所示：

2.4单位细胞中整合型HIV-DNA的拷贝数根据上述结果，用样本整合型 HIV-DNA的拷贝数/样本CD3拷贝数，即得到单位细胞中的HIV-1整合拷贝数，结果如图1所示。将病毒载量<20IU/ml的患者、耐药患者和初诊患者分别定义为A、B、C组，通过各组两t检验的比较，可知各组间差异无统计意义(P>0.05)。

图1 3组患者单位细胞中整合型HIV-DNA拷贝数Fig.1 Copies of integrated HIV DNA per cell in three groups

3 讨论

高效抗逆转录病毒治疗(Highly active anti-retroviral therapy,HAART)自应用以来，降低了患者体内的HIV病毒载量水平，然而却不能彻底清除患者体内的病毒，其主要原因在于病毒潜伏库的存在。病毒潜伏库在疾病的急性期即病毒感染后几天内产生，同时在病毒活跃复制的过程中不断产生。已知含有整合HIV DNA的静止性CD4+T细胞是最主要的 HIV潜伏库。因此，研究整合型HIV对于探讨HIV的致病机制及最终清除病毒具有重要的意义[7]。

Alu-PCR是目前常用的检测整合型HIV DNA的实验方法。Alu序列是人类特有的，在基因组中广泛分布并高度保守的间隔重复序列，平均间隔4 000 bp。根据 Alu序列和HIV基因组中的相对保守序列分别设计引物，可得到整合型HIV基因。本实验先构建了ACH2细胞系，使每个细胞含有一个HIV基因组。

本研究建立的该方法与基于体外培养的潜伏库测定技术相比，简便、快速，成本较低比较适合临床标本的检测，作为一种监测和评估手段，检测病毒潜伏库的大小，可以初步判定临床药物的效果。同时也为新的干预治疗方法提供了一种评估依据。尤其对病毒载量低拷贝的标本更具有检测意义，为HIV早期感染的诊断也提供了一定的参考依据。然而目前关于潜伏库的定量检测研究主要集中在外周血，研究发现在中枢神经系统及淋巴组织中HIV也保持着低水平的复制[10]，因此要精确定量HIV潜伏库的大小，仍需要在HIV潜伏库的形成机制及调控方面做更进一步的深入探讨。

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