余占娟 王月霞 吕豪 李向阳

325035 温州医科大学(余占娟、李向阳)；324000 衢州市中心血站(王月霞、吕豪)

有报道我国人群中HBsAg携带率为7.18%[1]，2005年报道显示衢州市人群的HBsAg阳性率平均为3.21%，属乙肝中流行[2]。如何降低输血感染，确保输血安全，一直是国内外关注的热点之一。由于条件限制，我国大多数血站一直采用两种不同厂家的ELISA试剂检测输血传染指标，虽然这个方法的检测技术不断在提高，但仍存在一定的局限性，窗口期、隐匿性乙肝、HBV基因突变等因素都可能造成HBV漏检。

为进一步提高我国临床用血安全水平、降低经输血传播疾病风险，卫生部在《全面推进血站核酸检测工作实施方案(2013—2015年)》提出到2015年底2016初全国血液筛查基本覆盖核酸检测。NAT直接检测病毒DNA/RNA, 比ELISA更早地检出处于窗口期的标本。本调查就我站开展标本送金华血站集中化核酸检测后HBV血清学检测和NAT检测结果分析比较，探讨核酸检测对降低衢州地区HBV输血感染的意义。分析如下：

1 材料与方法

1.1标本来源收集2016年3月到2017年3月期间衢州市中心血站检验科检测的献血血液标本共27 646人份,其中首次献血10 548人份、再次献血17 098人份。每个献血者同时留取两份血液标本，分别用于ELISA检测和核酸检测。根据《血站技术操作规程》，核酸标本需要采集4 h内3 500×g离心15 min并于2～8 ℃冰箱保存，标本采集后送金华血站检测，72 h内完成检测，血液标本包装盒和运送过程符合国家相关要求。

1.2方法、试剂与仪器

1.2.1 检测方法：血液标本采集后于次日进行ELISA检测、并将核酸管送往金华血站进行核酸检测。ELISA检测HBsAg采用双抗体夹心法。NAT检测HBV DNA引物由上海浩源生物有限公司提供，靶基因为HBV C区，反应条件：步骤一，UNG酶启动：37 ℃×2 min，1个循环数；步骤二，UNG酶反应：50 ℃×5 min，1个循环数；步骤三，反转录：42 ℃×35 min，1个循环数；步骤四，核酸变性：94 ℃×10 min，1个循环数；步骤五，扩增、变性、退火、延伸：94 ℃×10 s、55 ℃×15 s、65 ℃×45 s，45个循环数(注65 ℃采集全部荧光信号)。

1.2.2 主要试剂与仪器：ELISA试剂盒：厦门英科新创乙肝表面抗原诊断试剂盒；英国索林乙肝表面抗原诊断试剂盒。仪器：Hamilton Star7560全自动加样仪，FAME3443酶免分析仪。NAT试剂盒：上海浩源乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒/人类免疫缺陷病毒(1型)三合一核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)，本品采用仪器自动化提取，按照8的系数等体积合并检测样本，取1.2 ml进行核酸提取，如果检测结果为反应性需进行拆分检测，拆分检测直接取需拆分标本1.2 ml进行核酸提取。仪器：ChiTas bss1200加样提取仪；ABI7500扩增仪。

1.3判定标准ELISA检测结果s/co值<1.0为阴性，s/co值1.0为阳性。双试剂阴性则判定结果为阴性；单一试剂阳性，则双孔复查，均为阴性则判断结果为阴性，有一孔以上有阳性则判定结果为阳性；双试剂阳性则判定结果为阳性；NAT检测确认ELISA检测结果，ELISA检测阳性NAT检测阳性则判断ELISA结果阳性；ELISA检测阴性NAT检测阳性则判定ELISA结果阳性。

1.4输血残余风险评估方法根据“发病率/窗口期”数学模型计算公式[3-4]计算。R=ΣRi；Ri=(WFi+HFi)×Di；WFi=Ii×(Li/365)；HFi=E×Pi。R:单位血液未检测出HBV阳性加权平均数;Ri:各分组单位血液未检测出HBV阳性数；Pi:各分组乙肝病毒现患率；Ii:各分组乙肝发病率；WFi:各分组窗口期风险相关因素; HFi:各分组人为因素或其他所致的试验误差;Di：各分组百分比;E:检测试验差错率;Li:乙肝窗口期(d)；i:首次献血组和重复献血组。首次献血者发病率=(重复献血者发病率×首次献血者现患率)/重复献血现患率。重复献血者发病率=重复献血现患率/重复献血间隔时间。简化公式:R=(Li/T+E)×(ΣPi*Di)。T:重复献血间隔时间(d)。

1.5确定参数窗口期(Li)长短与使用试剂、方法相关。根据相关文献[4-5]确定ELISA检测HBsAg的窗口期为59 d, NAT检测HBV DNA的窗口期为20 d。差错率(E)参考文献[4,6]，本实验室近3年参加约500份室间质评检测，有1份结果不符合预期，金华核酸实验室未出现室间质评结果不符合情况，故计算本实验室的差错率为0.2%，金华核酸实验室的差错率为0。重复献血间隔时间(T),由浙江省血液中心信息中心提供为587 d。

2 结果

2.1检测结果2016年3月至2017年3月共27 646份衢州地区无偿献血血液。HBV检测结果为ELISA检测阳性，NAT检测阳性的标本有76例；ELISA检测为阴性，NAT检测为阳性的标本有31例；NAT检测阳性的标本一共有107例。详见表1。

2.2计算方法采用简化公式R=(Li/T+E)×(ΣPi*Di)计算，ELISA检测后HBV输血残余风险为28.2×10-5，NAT检测后HBV输血残余风险为 13.0×10-5，NAT检测对ELISA检测降低输血感染HBV残余风险程度=(R1-R2)/R1=(28.2×10-5-13.0×10-5)/28.2×10-5=53.9%。详见表2。

3 讨论

HBV可经输血传播，与病毒自身、检测方法和受血者状况等因素密切相关[7]。随着献血相关法律法规的完善以及检测技术的革新换代，HBV输血传播90%的风险来源于病毒“窗口期”[8]，当今酶免技术还不能检出隐匿性乙肝、基因突变以及血清学转换前的“窗口期”，而NAT直接检测HBV-DNA，可以很大程度解决这些漏检问题，乙肝窗口期更由原来ELISA的59 d降至20 d，大大减低窗口期给输血带来的风险。本次选取的27 646份无偿献血者血液标本，经检测乙肝总阳性率占0.39%，远远低于我国人群HBsAg携带率7．18%[1]和衢州市人群的HBsAg阳性率平均为3．21%[2],这和参加献血人群大多是健康人群以及献血前的健康征询、快速试纸条的初筛有重要关系。

表1 衢州地区27 646份无偿献血血液HBV检测情况[n(%)]

表2 2016年3月至2017年3月衢州地区无偿献血血液HBV残余风险

很多国家使用NAT 估计来自窗口期的风险[9-10]。本分析采用“发病率/窗口期”模型[11]，将ELISA检测阴性NAT检测阳性的标本数看作窗口期的标本数。结果显示NAT检测后HBV输血残余风险显著下降，符合相关报道中NAT可降低HBV输血传播40%～50%的残余风险[12]。

综合上述表明，开展核酸检测技术能有效的降低衢州地区HBV输血感染的残余风险，对保证临床输血安全有重大意义。

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