何李英 周永明 古文鹏 许万福 张顺先 艾琳 卢艳 田利光

510630 广州，暨南大学第一临床医学院(何李英)；510623 广州市妇女儿童医疗中心消化科(何李英、许万福、张顺先)；650022 昆明，云南省疾病预防控制中心(周永明、古文鹏)；200025 上海，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(张顺先、艾琳、卢艳、田利光)

人杯状病毒(Human calicivirus，HuCV)是儿童急性胃肠炎的重要病原体之一，在世界各地都有广泛传播，它包括诺如病毒(Norovirus，NoVs)和札如病毒(Sapovirus，SaV)。NoVs是一组小、无包膜、球形结构的单链RNA病毒[1- 2]，根据叔丁基4-羟基茴香醚(BHA)多聚酶及衣壳蛋白区域序列的差异又分为六个基因群组(40个基因型)：G I、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GV和GVI，其中G I、GII和GIV群可感染人[1-2]。目前，NoVs已成为全年龄组人群急性非细菌性腹泻的主要病原体之一，主要通过粪-口途径传播，临床表现为低热、恶心、呕吐、腹痛和水样腹泻，严重者可出现脱水甚至死亡[3]。儿童感染NoVs后以呕吐为主，而成人主要表现为短期腹泻[3]。65岁以上人群和免疫功能缺陷患者感染NoVs后，腹泻时间较长[1]。

全球腹泻人群中NoVs的阳性率约为18.0%，其阳性率在<5岁腹泻儿童和>5岁腹泻人群中无差异(均为18.0%)[4]。1999年以来中国开展的<5岁儿童病毒性腹泻原体监测结果显示NoVs的阳性率为8.3%～38.6%[5- 6]，在成人门诊腹泻病例中阳性率为11.9%～26.2%[7-9]。本研究通过揭示昆明市杯状病毒及NoVs GII的分子流行特征，为相关腹泻疾病的防控提供科学参考。

1 材料与方法

1.1样本来源以云南省第一人民医院、昆明医科大学第一附属医院、昆明市儿童医院和昆明市普吉社区医院为哨点医院，从这4个医院选择腹泻病例和对照。标本采集获得患者或家属知情同意。

腹泻病例入选标准：1)2014年7月1日至2015年6月30日，在上述4家医院就诊的<5以下儿童；2)在过去24 h内，排便次数≥3次且形态异常；3)本次腹泻和上次腹泻的时间间隔超过2周。

非腹泻人群的入选标准：1)2014年7月1日至2015年6月30，在上述4家医院就诊的<5以下儿童；2)过去2周内没有腹泻症状；4)无其他主要的消化道疾病。

1.2样本的采集与保存从以上4个医院无菌采集腹泻病例和非腹泻研究对象的粪便样本，固体粪便每份取5～10 g，水样便或稀粪便每份取5～10 ml，采集的标本放入螺口采样盒并将置于-80 ℃。

1.3仪器与试剂主要试剂：病毒核酸提取试剂盒(Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ，Geneaid，中国)，SuperScriptⅢ逆转录酶(SuperScript III，Invitrogen，Carlsbad，CA)，随机引物(Promegan，Madison，USA)、dNTP MIX、GoTaq DNA 聚合(Promega，USA)，PCR Taq Mix(大连宝生物，中国)，引物(表1)由上海生工合成。主要仪器：核酸电泳及凝胶成像系统和PCR仪(Bio-Rad 公司，USA)。

1.4病毒核酸提取、检测、基因分型取出冻存的粪便样本，待自然解冻后，取0.1 g或0.1 ml粪便至1.5 ml EP管，并加入0.9 ml PBS，混匀，并制成10%悬液，8 000×g离心5 min，取上清待检。

按说明书提取病毒RNA,采用逆转录聚合酶链反应合成cDNA，反应条件为：42 ℃，90 min；99 ℃，5 min；4 ℃保存。

杯状病毒的检测采用多重PCR法。反应体系为25 μl：cDNA 1 μl、三对上下游引物(289H-290 K)各1 μl、2×PCR Taq Mix 12.5 μl和去离子水5.5 μl。扩增条件为：94 ℃,5 min； 94 ℃,1 min、49 ℃，1 min、72 ℃，1 min，循环40次；72 ℃，10 min。取5 μl扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果，若出现目的条带(331/319 bp)，对相应扩增产物进行测序，将测序结果在NCBI网站上通过BLAST比对以确定是否为杯状病毒感染、及杯状病毒的亚型和基因型。

表1 杯状病毒RT-PCR引物

1.5分子进化分析将测序得到的序列提交GenBank进行Blast相似性比较与同源性分析，并与GenBank中具有代表性的NoVs序列用软件Clustal X进行比对。使用Mega 6.0软件中的邻接法，对NoVs RdRp区的基因构建进化树，分析NoVs各亚型的进化特征。

表2 腹泻病例中NoVs GII阳性者的特征

注：a秩和检验；b卡方检验

Notes：arank sum test;bchi square test

1.6统计学方法用SPSS24.0 软件(IBM，US)进行数据分析，分类资料的OR值及95%可行区间(CIs)计算采用卡方检验或Fisher检验；定量资料选择t检验、方差分析或K-W秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1杯状病毒及亚型在腹泻病例和非腹泻病例中的比较腹泻儿童杯状病毒阳性者有98例(11.5%)，其中诺如病毒GII有94例(11.1%)，诺如GI有1例(0.1%),扎如病毒有3例(0.4%)。非腹泻人群中杯状病毒阳性者有8例(4.7%)，其中诺如GII有8例(4.7%)，扎如和诺如GI没有检出。腹泻儿童中杯状病毒的阳性率高于非腹泻儿童(χ2=7.083，P=0.008)，其中，NoVs GI的阳性率(P=0.833)和扎如病毒的阳性率(P=0.578)在腹泻儿童中和非腹泻儿童中差异无统计学意义，而NoVs GII的阳性率在腹泻儿童中高于非腹泻儿童(11.1%，4.7%，χ2=6.353，P=0.012)。其中GII.P3的阳性率在腹泻儿童中高于非腹泻儿童P=0.036。其他基因型如GII.P、 GII.P5、 GII.P12和GII.P17的阳性率在腹泻儿童和非腹泻儿童中差异没有统计学意义。

2.2腹泻病例中诺如病毒阳性者特征在腹泻儿童中NoVs GII阳性和NoVs GII阴性的年龄差异无统计学意义(χ2=0.398，P=0.691)，其年龄中位数均为0.92岁。NoVs GII阳性者的腹泻次数多于NoVs GII阴性者的腹泻次数(χ2=9.251，P<0.001)。发热在NoVs GII阳性和NoVs GII阴性者中差异无统计学意义(χ2=0.008，P=0.928)，呕吐在NoVs GII阳性者中高于NoVs GII阴性者(χ2=29.734，P=0.001)，脱水在NoVs GII阳性者中高于NoVs GII阴性者(χ2=18.880，P=0.001)，水样便和黏液样便在NoVs GII阳性者中高于NoVs GII阴者(χ2=17.920，P<0.001；χ2=15.077，P<0.001)(表2)。

2.3腹泻病例中NoVsGII及基因型年龄分布特征将850名腹泻儿童分成3个不同的年龄组：<1岁、1～2岁、2～5岁，其中<1岁组449人、1～2岁组269人、2～5岁有132人。NoVs GII的阳性率在不同年龄组的腹泻人群中差异无统计学意义(χ2=0.620，P=0.733)。GII.P3的阳性率在不同年龄组的腹泻人群中差异有统计学意义(χ2=6.680，P=0.035)。GII.P4、GII.P5、GII.P12和GII.P17的阳性率在不同年龄组的腹泻人群中差异均无统计学意义(表3)。

表3 腹泻儿童中NoVs GII及基因型年龄分布

2.4NoVsGII及基因型在腹泻儿童中的性别分布特征NoVs GII的阳性率在不同性别的腹泻儿童中差异无统计学意义(χ2=0.038，P=0.846)。GII.P4的阳性率在男性腹泻儿童和女性腹泻儿童中差异无统计学意义(4.5%，n=19；5.7%，n=24；χ2=0.637，P=0.425)，其他基因型的阳性率在不同性别间差异均无统计学意义(表4)。

表4 腹泻人群中NoVs GII及基因型性别分布

2.5NoVsGII基因型在腹泻儿童中的季节分布特征根据昆明市气候特征，将2～4月定义为春季、5～7月为夏季、8～10月为秋季、11月到次年1月为冬季，分别收集到腹泻病例180名、136名、192名和342名。腹泻儿童中NoVs GII的阳性率有明显的季节趋势(χ2=9.867，P=0.020)，流行高峰为秋季(15.6%)，低谷为冬季(7.9%)。其中，GII.P4和GII.P12的流行也有明显的季节趋势(χ2=8.881，P=0.031；χ2=7.917，P=0.039)，流行高峰为秋季(8.9%、5.7%)，低谷为冬季(3.2%、1.5%)。其他基因型(GII.P3、GII.P5、GII.P17)的流行没有季节特征。

2.6NoVsGII进化分析总共102株NoVs GII被检出且都成功测序，选取代表性的序列进行系统进化分析(图1)。结果表明GII.4中GII.4_Sydney2 012株占优势，GII.4_2006b很少，GII.4_Orleans2 009株没有检出。同时也检出GII.P17。

3 讨论

HuCV是人类急性非菌性胃肠炎的主要病原体之一[1]，其中NoVs占HuCV的绝大多数。由于NoVs具有感染剂量低和缺乏持续免疫力等特点，人群对NoVs普遍易感，导致NoVs相关腹泻经常在医院、疗养院和学校等人多密集的半封闭环境中暴发[2, 4,9]，同时也引起很多散发的腹泻病例。

本研究发现NoVs GII的阳性率在腹泻儿童中高于非腹泻儿童，说明NoVs GII是引起腹泻的重要的肠道病原体之一，这与很多研究的结论相似[4]。本研究发现腹泻儿童NoVs GII阳性率为11.1%[6-7]，这与全国NoVs GII在儿童中感染水平基本一致。非腹泻儿童中NoVs GII感染但不出现腹泻症状可能与感染者机体免疫力较强、感染的病毒剂量较低等因素有关。

▲：腹泻人群，●：健康对照图1 NoVs GII聚合酶区系统进化树▲: diarrhea cases；●: healthy controlsFig.1 Phylogenetic tree of RNA polymerase region among NoV GII in Kunming City

本研究发现GII.P4仍是NoVs GII的优势基因型，而GII.4_Sydeny2012株是GII.4的优势株，GII.4_2006b株呈现低流行状态，GII.4_Orleans_2009株并未被检出，这与全国近年来年NoVs监测的结果相似。与此同时，本研究发现NoVs GII流行的高峰期是秋季，这与中国NoVs GII流行特征相符[7]。我国NoVs GII的流行特征和欧美地区不同，2009年欧美地区GII.4_Orleans 2009株成功取代GII.4_2006b株，并成为优势株；到2012年GII.4_Sydney 2012株则成功取代GII.4_Orleans 2009株成为优势株[6-7, 10]，尽管2014年下半年以来，GII.17基因型在广东和江苏等地区引起大量暴发性腹泻事件和散发性腹泻病例[11-12]，但在昆明GII.17并未取代GII.4成为优势基因型。

本研究发现NoVs GII在<5岁腹泻人群流行程度较高，存在多种基因型，且以GII.P4为优势型别，同时也发现新基因型GII.P17。因此，继续加强对HuCV(包括NoVs GII)的病原学监测，了解其流行型别的动态变化，以便有效防控相关腹泻。

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