张 顺 杜 涛 蒋小华 宋 纯

上海市东方医院(同济大学附属东方医院)胃肠外科(200127)

缺氧诱导因子-2α在小鼠DSS结肠炎中的作用及其机制研究

张 顺*杜 涛 蒋小华 宋 纯#

上海市东方医院(同济大学附属东方医院)胃肠外科(200127)

背景：对炎症性肠病(IBD)发病机制的研究发现微循环缺氧是IBD的重要特征之一，转录因子缺氧诱导因子(HIFs)在缺血缺氧损伤的调节中起关键作用。目的：探讨HIF-2α在小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎中的作用及其可能机制。方法：以Mx-Cre/LoxP 重组方法获得HIF-2α基因条件性敲除(HIF-2α -/-)小鼠，将C57BL/6、HIF-2α +/+和HIF-2α -/-小鼠分别随机分入DSS模型组和饮水对照组，前者予4% DSS溶液自由饮用7 d制作结肠炎模型，造模过程中每天评估疾病活动指数(DAI)。各组小鼠分别于造模开始后第1、3、5、7 d处死，取结肠组织观察组织病理学变化，real-time PCR检测HIF-2α、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA表达。结果：造模过程中，C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型组小鼠结肠黏膜HIF-2α mRNA表达明显升高，DAI和结肠黏膜炎症评分显著高于C57BL/6饮水对照组(第5、第7 d，P<0.05)。HIF-2α -/- DSS模型组小鼠结肠黏膜炎症损伤较HIF-2α +/+ DSS模型组进一步加重，DAI和炎症评分进一步升高(除第7 d炎症评分外，P均<0.05)，结肠黏膜TNF-α mRNA表达亦较HIF-2α+/+ DSS模型组显著升高(第5、第7 d，P<0.05)。结论：HIF-2α可能通过抑制TNF-α表达发挥减轻小鼠DSS结肠炎炎症损伤的作用。

结肠炎； 缺氧诱导因子2，α亚基； 肿瘤坏死因子α； 小鼠，基因敲除

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一类病因不明、以肠道慢性炎性反应为特征的疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)[1]。IBD严重危害人类健康且患者发生结直肠癌的概率明显高于一般人群，因此越来越受到研究者的关注[2-3]。近年来，缺血缺氧与IBD的关系逐渐成为IBD发病机制的研究方向之一[4]。IBD患者的肠道上皮细胞处于缺氧环境中，微循环缺氧是IBD的一个重要特征，而机体通过分子调控保护上皮细胞是组织缺氧适应性反应的重要组成部分[4-5]。近年来，众多实验研究表明缺氧诱导因子-1α亚基(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在肠道炎症中起保护作用[6-7]。本研究以HIF-2α基因条件性敲除小鼠为实验对象，探讨HIF-2α在实验性结肠炎中的作用及其可能机制。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

雄性C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，SPF级，购自中国科学院上海实验动物中心，饲养于SPF级环境中，自由进食、饮水。Mx-Cre转基因小鼠(JAXMICE:003556)和HIF-2α-LoxP标记小鼠(JAXMICE:008407)引进自美国Jackson实验室。HIF-2α-LoxP标记小鼠与Mx-Cre转基因小鼠交配后，经两次传代和基因型鉴定筛选，获得Mx-Cre阳性HIF-2α纯和子LoxP标记小鼠。对此种小鼠连续3次腹腔注射聚肌胞，通过诱导干扰素产生获得全身HIF-2α基因敲除小鼠(HIF-2α -/-)[8]。同时构建Mx-Cre阴性HIF-2α纯合子LoxP标记小鼠(HIF-2α +/+)作为对照组。

葡聚糖硫酸钠(DSS)(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，TRIzol®RNA分离试剂(Thermo Fisher Scientific Inc.)，PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)、SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)。

二、方法

1. 实验动物分组和模型制作：将C57BL/6、HIF-2α +/+和HIF-2α -/-小鼠分别随机分入DSS模型组和饮水对照组，每组20只，前者予4% DSS溶液自由饮用7 d制作结肠炎模型[9]，后者予蒸馏水自由饮用7 d。造模过程中每天观察小鼠体质量、活动情况、毛色变化以及粪便颜色、性状、有无出血等情况。

2. 标本采集和处理：各组小鼠分别于造模开始后第1、3、5、7 d以颈椎脱臼法分批处死(每一时点处死5只)，分离全结肠，观察大体肠壁，沿肠系膜剪开肠腔，冰PBS冲洗，取炎症黏膜组织，部分于-80 ℃ 保存，部分4%甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋、切片，HE染色。

3. 疾病活动指数(DAI)评估：根据小鼠体质量下降程度、粪便性状和隐血情况进行评分[10]。

4. 结肠黏膜炎症评分：于光学显微镜下观察结肠黏膜组织病理学变化，根据炎症程度分为0～4级[11]。0级：结肠黏膜结构正常，未见炎性细胞浸润；1级：少量白细胞浸润；2级：中度白细胞浸润；3级：大量白细胞浸润，中度纤维化，肠壁增厚，中度杯状细胞消失，局部隐窝消失；4级：炎性细胞浸润至黏膜下，肠黏膜结构破坏，大量杯状细胞消失。

5. Real-time PCR：取冻存结肠组织约50 mg，匀浆后以TRIzol®试剂提取总RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录合成cDNA，以之为模板行real-time PCR扩增，引物由TAKARA BIO INC.设计、合成。HIF-2α引物序列：F 5’-CAG GCA GTA TGC CTG GCT AAT TCC AGT T-3’, R 5’-CTT CTT CCA TCA TCT GGG ATC TGG GAC T-3’；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)引物序列：F 5’-AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT-3’, R 5’-CCA CCA CGC TCT TCT GTC TAC-3’；内参β-actin: F 5’-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C-3’, R 5’-ATG GAG CCA CCG ATC CAC A-3’。PCR反应体系：SYBR®Premix Ex TaqTM12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加蒸馏水至25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。实验重复3次。

三、统计学分析

结 果

一、结肠炎症损伤

C57BL/6、HIF-2α +/+和HIF-2α -/-饮水对照组小鼠造模过程中DAI和结肠黏膜炎症评分均趋于0，各组间差异无统计学意义(P>0.05)。C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型组小鼠DAI随饮用DSS溶液时间的延长逐渐升高，结肠黏膜可见中重度充血水肿和浅溃疡，第5、第7 d DAI和炎症评分与C57BL/6饮水对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(图1A、1B)。与HIF-2α +/+ DSS模型组相比，HIF-2α -/- DSS模型组小鼠结肠黏膜炎症损伤进一步加重，第3、5、7 d DAI和炎症评分均高于HIF-2α +/+ DSS模型组，除第7 d炎症评分外，两组间差异均有统计学意义(P<0.05)(图1C、1D)，提示HIF-2α在DSS结肠炎中可能发挥减轻结肠炎症损伤的作用。

二、HIF-2α mRNA表达变化

Real-time PCR结果显示，与相应饮水对照组相比，C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型组小鼠结肠黏膜HIF-2α mRNA相对表达量明显升高，第5、第7 d 两组间差异有统计学意义(P<0.05)(图2)，证实HIF-2α在DSS结肠炎中表达上调。

三、HIF-2α对DSS结肠炎TNF-α mRNA表达的影响

Real-time PCR结果显示，与HIF-2α +/+ DSS模型组相比，HIF-2α -/- DSS模型组小鼠结肠黏膜TNF-α mRNA相对表达量明显升高，第5、第7 d两组间差异有统计学意义(P<0.05)(图3)，表明HIF-2α在DSS结肠炎中可能抑制TNF-α表达。

讨 论

IBD在西方国家相当常见，患病率为100～200/10万，近10年来，我国IBD患病率呈明显上升趋势。迄今为止，IBD的病因和发病机制尚不十分明确，现有治疗措施亦有限，因此开展IBD的防治研究具有重要临床意义。

目前IBD发病机制相关研究集中在环境、遗传、感染、免疫因素等方面，认为IBD是一种由环境因素作用于遗传易感个体而引起的肠道黏膜异常免疫反应， 近年来， 缺血缺氧与IBD的关系亦逐渐成为研究方向之一[4]。HIFs是一组由结构同源的α亚基和共同的β亚基组成的异二聚体转录因子，包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，在缺血缺氧损伤的调节中起关键作用[12]，其中HIF-1和HIF-2是细胞缺氧适应性反应中最重要的调节因子。HIF-2由HIF-2α和HIF-1β两个亚基组成，靶基因涉及血管生成、糖酵解、干细胞自我更新、血管收缩和舒张、骨髓造血、能量代谢、儿茶酚胺合成、铁平衡等多个方面[5，13-14]。HIF-1β亚基又称ARNT(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator)，为HIF-2的结构性亚基，在正常细胞和缺氧细胞的胞质和胞核中均有表达，表达水平极少发生波动[15]；HIF-2α亚基则为HIF-2的功能性和活性亚基，是诱导低氧反应基因修复细胞氧内环境稳定的核心调节因子，对于在急性缺血缺氧损伤状态下保护细胞免于凋亡、维持肠上皮的再生和增殖能力至关重要[16-17]。

*与同时间点C57BL/6 饮水对照组(A、B)或HIF-2α +/+ DSS模型组(C、D)比较，P<0.05

*与同时间点相应饮水对照组比较，P<0.05

*与同时间点HIF-2α +/+ DSS模型组比较，P<0.05

目前关于HIFs在IBD中作用的研究报道主要集中于HIF-1α，并发现其在结肠炎动物模型中可通过维持黏膜屏障而发挥保护作用[6-7]，HIF-2α与IBD关系的研究结论则并不一致。一些研究发现HIF-2α在活动性IBD患者的结肠组织中呈高表达[5，18]，多数研究支持HIF-2α在炎症状态下激活起保护作用，可维持肠上皮内稳态[19]，但亦有研究显示HIF-2α在IBD中起促进而非抑制炎症反应的作用，可上调肠上皮细胞促炎细胞因子TNF-α表达，敲除HIF-2α的结肠炎模型小鼠结肠炎症减轻，过表达者则对结肠炎易感[18]。本研究通过饮用4% DSS溶液建立小鼠结肠炎模型，探讨HIF-2α在IBD中的可能作用及其机制。实验结果显示，C57BL/6和HIF-2α +/+ DSS模型组小鼠结肠黏膜HIF-2α mRNA表达较相应饮水对照组显著升高，提示HIF-2α在DSS结肠炎中起重要作用。进一步以HIF-2α基因敲除小鼠重复DSS结肠炎模型，发现HIF-2α -/- DSS模型组小鼠DAI和结肠黏膜炎症评分均显著高于HIF-2α +/+ DSS模型组，两组间DAI在造模开始后第3～7 d差异均有统计学意义，但炎症评分的组间差异至第7 d已无统计学意义，可能与此时模型动物的结肠黏膜炎症损伤达到最高峰有关。综合上述结果，提示HIF-2α在DSS结肠炎中可能起减轻结肠炎症损伤的作用。

促炎细胞因子TNF-α在IBD肠道炎症反应中居核心地位，其主要以旁分泌和自分泌方式在局部发挥作用，使内皮细胞表达黏附分子，从而使各类免疫炎症相关细胞，如单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等聚集于炎症局部，分泌TNF-α以及其他炎症因子，放大炎症级联反应，最终导致黏膜组织损伤甚至坏死[20-21]。既往研究发现缺氧可诱导多种细胞分泌TNF-α[22]，且HIF-2α基因失活可增加上皮炎症细胞浸润[23]，故推测HIF-2α具有抑制上皮细胞分泌TNF-α的作用。本研究发现，HIF-2α +/+ DSS模型组小鼠的结肠黏膜HIF-2α mRNA表达在造模过程中逐渐升高，在相同时间段内，HIF-2α -/- DSS模型组小鼠结肠黏膜TNF-α mRNA表达呈持续升高趋势，伴DAI和结肠黏膜炎症评分升高，且三者造模全程均明显高于HIF-2α+/+ DSS模型组，表明HIF-2α与TNF-α之间存在负相关趋势，HIF-2α可能通过抑制TNF-α表达减轻DSS结肠炎症损伤。

综上所述，本研究发现在小鼠DSS结肠炎中，结肠黏膜HIF-2α表达与TNF-α表达以及DAI和结肠黏膜炎症评分之间存在负相关趋势，推测HIF-2α可能通过抑制TNF-α表达发挥减轻结肠炎症损伤的作用。进一步认识HIF-2α参与调控IBD炎症损伤的机制将为以之为靶点的IBD干预策略提供理论基础和实验依据。

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(2016-07-02收稿；2016-07-17修回)

Effect of Hypoxia-inducible Factor-2α on Mice DSS Colitis and its Possible Mechanism

ZHANGShun,DUTao,JIANGXiaohua,SONGChun.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,ShanghaiEastHospital(EastHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity),Shanghai(200127)

SONG Chun, Email: chunsong163@163.com

Colitis; Hypoxia-Inducible Factor 2, alpha Subunit; Tumor Necrosis Factor-alpha; Mice, Knockout

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.006

*Email: v2zs@hotmail.com

#本文通信作者，Email: chunsong163@163.com

Background: There is increasing evidence that microcirculation hypoxia plays an important role in pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). Hypoxia-inducible factors (HIFs) are transcriptional factors that serve as master regulators in ischemic and hypoxia injuries. Aims: To investigate the effect of HIF-2α on dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice and its possible mechanism. Methods: Mx-Cre/LoxP recombination system was utilized to establish a conditional HIF-2α gene knockout (HIF-2α -/-) mouse model. C57BL/6, HIF-2α +/+ and HIF-2α -/- mice were randomly allocated into DSS colitis group and water drinking group, respectively. Experimental colitis was induced by treatment with 4% DSS in drinking water for 7 days, and the disease activity index (DAI) was assessed daily. Mice in each group were sacrificed on day 1, 3, 5 and 7 in batch; the histopathological changes of colonic tissue were observed, and mRNA expressions of HIF-2α and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by real-time PCR. Results: During model establishment, expression of HIF-2α mRNA in colonic tissue was elevated in C57BL/6 and HIF-2α +/+ DSS colitis groups, and the DAI and colonic inflammatory score were significantly higher than those in C57BL/6 water drinking group (P<0.05 on day 5 and day 7). Compared with HIF-2α +/+ DSS colitis group, HIF-2α -/- DSS colitis group had more severe colonic inflammatory injury and the DAI and inflammatory score were further increased (Pall <0.05, except the inflammatory score on day 7); expression of TNF-α mRNA in colonic tissue was also increased significantly in HIF-2α -/- DSS colitis group (P<0.05 on day 5 and day 7). Conclusions: HIF-2α may ameliorate colonic inflammatory injury in mice with DSS colitis via inhibition of TNF-α expression.