翁 燕，刘丽娜，周小燕，谌杰亮

建立UPLC法测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸的含量

翁 燕1，刘丽娜2，周小燕2，谌杰亮3

目的 通过优化色谱条件建立UPLC法测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸的含量。方法 以9种氨基酸对照为外标物，异硫氰酸苯酯为柱前衍生剂，采用ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱,流动相A为0.1 mol/L的醋酸钠溶液(用冰醋酸调整pH至6.50)-乙腈(93∶7)，流动相B为乙腈-水(4∶1)，检测波长254 nm，流速为0.45 mL/min，柱温36 ℃。结果 复方氨基酸胶囊(9-5)中9种氨基酸出峰时间与对照品出峰时间一致，其他物质无干扰；仪器精密度RSD为0.5%～1.2%，中间精密度RSD为1.3%～1.9%；各氨基酸的溶液浓度与其峰面积线性关系良好(r≥0.999)，溶液稳定性RSD为0.6%～1.8%，各氨基酸的平均回收率在95.0%～105.0%之间。含量测定方法比对实验中UPLC法与HPLC法分析结果无明显差异，分析速度明显提高。结论 建立的UPLC法高效，快速，灵敏，准确，可用于测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸的含量。

异硫氰酸苯酯；复方氨基酸胶囊(9-5)；UPLC；氨基酸；方法学验证

0 引言

氨基酸(Amino acid)是含氨基和羧基的有机化合物的统称，是构成生物体蛋白质的基本单位。氨基酸广泛应用于医药、食品、保健、饲料、化妆品、农药、制革、科学研究等领域[1]。

现今复方制剂种类虽多，但复方氨基酸胶囊种类屈指可数。复方氨基酸胶囊(8-11)由8种必需氨基酸、11种维生素和5-羟基邻氨基苯甲酸盐组成的复方制剂。含各种氨基酸应为标示量的80.0%～120.0%[2]。复方氨基酸胶囊(9-5)为9种氨基酸与5种维生素制成的复方制剂，含异亮氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、盐酸精氨酸均应为标示量的80.0%～120.0%。本文研究对象为复方氨基酸胶囊(9-5)。在复方氨基酸胶囊(9-5)的质量标准中，氨基酸含量测定是必检项目。目前采用HPLC检测方法，出现了异亮氨酸及亮氨酸分离度达不到要求、样品分析时间长等问题。本实验通过建立UPLC的方法来解决样品分析时间长的问题；同时调整梯度条件，以提高异亮氨酸和亮氨酸的分离度。

氨基酸的分析方法主要有茚三酮柱后衍生化法，异硫氰酸苯酯(PITC)柱前离线衍生化法，邻苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯(OPA-FMOC)柱前在线衍生化法，2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前离线衍生化法[3-7]等；实验室常用的含量测定方法主要为紫外可见分光光度法[3-4]，高效液相色谱法[8]。

结合实验室的实际条件，本实验采用异硫氰酸苯酯(PITC)柱前离线衍生化法、超高效液相色谱(UPLC)法测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸含量，力求建立快速、灵敏、准确的UPLC分析方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UPLC(ACQUITY UPLC H-Class，沃特斯中国有限公司)，电子分析天平(XS105，梅特勒-托利多中国有限公司)，水浴锅(DK-S22，上海精宏实验设备有限公司)，烘箱(DHG-9067A，上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药 复方氨基酸胶囊(批号：07221、01151、03231，南京圣和药业)；精氨酸对照品(批号：140685-201003)、苏氨酸对照品(批号：140682-200401)、缬氨酸对照品(批号：140681-200401)、甲硫氨酸对照品(批号：140684-200401)、异亮氨酸对照品(批号：140683-200401)、亮氨酸对照品(批号：140687-200401)、苯丙氨酸对照品(批号：140676-200405)、色氨酸对照品(99.8%，批号：140686-200802)、盐酸赖氨酸对照品(批号：140673-201006)，均购于中国药品生物制品检验所，供含量测定用；盐酸精氨酸原料药(批号：SYJS140501)、缬氨酸原料药(批号：ATHR140702)、甲硫氨酸原料药(批号：AVAI140101)、异亮氨酸原料药(批号：2013091708)、亮氨酸原料药(批号：APAE14030)、苯丙氨酸原料药(批号：ALEU131221)、色氨酸原料药(批号：107-1404020)、盐酸赖氨酸原料药(批号：1031408012)，均购于天津天安药业股份有限公司，供药用；异硫氰酸苯酯(AR，≥98.0%，C1326045，Aladdin Industry corporation)；三乙胺(≥99.0%，批号：F20111102)、冰醋酸(AR，≥99.5%，批号：14102712292)、无水乙酸钠(AR，≥99.0%，批号：12110711921)，均购于国药集团化学试剂有限公司；正己烷(色谱纯，≥95.0%，批号：O9RM1H，Honeywell)，乙腈(色谱纯，批号：OBDA1H，Honeywell)。

2 UPLC法的建立过程

2.1 色谱条件的摸索 ACQUITY UPLC方法转换器(从HPLC至UPLC)，如图1、图2。

图1 HPLC与UPLC的色谱柱信息及HPLC的初始梯度

图2 转换后的流速、进样体积及洗脱梯度

实验操作中，按转换后的流速、进样体积及梯度进行样品分析，出现柱压过高、异亮氨酸和亮氨酸分离度达不到要求等问题。洗脱梯度摸索过程见表1～表4，图3。

表1 洗脱梯度1

表2 洗脱梯度2

表3 洗脱梯度3

表4 洗脱梯度4

图3 洗脱梯度摸索试验 UPLC色谱图

注：A.洗脱梯度摸索1，B.洗脱梯度摸索2，C.洗脱梯度摸索3，D.洗脱梯度摸索4；1.精氨酸,2.苏氨酸,3.缬氨酸,4.甲硫氨酸,5.异亮氨酸,6.亮氨酸,7.苯丙氨酸,8.色氨酸,9.盐酸赖氨酸

2.2 色谱条件的确定 总结比较上述4个不同梯度洗脱及其色谱图，确立的最终色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；检测波长：254 nm；柱温：36 ℃；进样量：0.4 μL；流速：0.45 mL/min；流动相A：0.1 mol/L醋酸钠溶液(用冰醋酸调整pH至6.50)-乙腈(93∶7)，流动相B：乙腈-水(4∶1)；梯度洗脱程序见表4。

3 方法与结果

3.1 溶液配制方法

3.1.1 对照品储备液的制备 精密称取精氨酸对照品约60.0 mg、苏氨酸对照品75.0 mg、缬氨酸对照品112.5 mg、甲硫氨酸对照品112.5 mg、异亮氨酸对照品112.5 mg、亮氨酸对照品127.5 mg、苯丙氨酸对照品75.0 mg、色氨酸对照品37.5 mg、盐酸赖氨酸对照品140.6 mg，分别置于50 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得上述9种氨基酸对照品储备液。

3.1.2 对照品溶液的制备 精密称取相应的氨基酸对照品适量(相当于异亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

3.1.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下内容物中的白色、红色、咖啡色颗粒，研细，精密称取适量(相当于异亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

3.1.4 柱前衍生 取对照品溶液和供试品溶液各2 mL，先加衍生剂A(0.1 mol/L的异硫氰酸苯酯乙腈溶液)1 mL，再加入衍生剂B(1.0 mol/L的三乙胺乙腈溶液)1 mL，摇匀，静置1 h后，加正己烷4 mL，充分振摇，放置使分层，吸取下层溶液，经0.22 μm有机膜滤得衍生后溶液。

3.2 方法学验证

3.2.1 专属性 氨基酸对照品溶液的制备：分别精密移取9种氨基酸对照品储备液0.13 mL，分别置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得：精氨酸对照品、苏氨酸对照品、缬氨酸对照品、甲硫氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品、苯丙氨酸对照品、色氨酸对照品、盐酸赖氨酸对照品。空白辅料溶液的制备：精密称取辅料适量(相当于异亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。取空白辅料溶液、空白溶剂(水)、供试品、上述9种氨基酸对照，按“3.1.4”项衍生方法处理得衍生后溶液，分别取衍生后溶液0.4 μL注入液相色谱仪，记录色谱图如图4～图7。

图5 样品UPLC色谱图

图6 空白溶剂UPLC色谱图

图7 精氨酸对照品UPLC色谱图

结论：供试品溶液主峰(以精氨酸为例)的保留时间与对照品溶液主峰一致；溶剂(水)、空白辅料对氨基酸出峰无干扰，专属性符合规定。

3.2.2 精密度 仪器精密度：取氨基酸对照品溶液，按“3.1.4”项衍生方法处理得衍生后溶液，分别取衍生后溶液0.4 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积与保留时间，求RSD%(峰面积RSD≤2.0%，保留时间RSD≤1.5%)。测定结果表明，各氨基酸峰面积的RSD为0.5%～1.2%，保留时间RSD为0.5%～0.9%，仪器精密度符合规定。中间精密度:两名分析人员分别对同一批产品进行检验。记录9种氨基酸的峰面积和保留时间，计算两人含量、保留时间的RSD(含量RSD≤2.0%，保留时间RSD≤1.5%)。两位分析人员测定结果表明，各氨基酸含量的RSD为1.3%～1.9%，保留时间RSD为0.7%～1.1%，中间精密度符合规定。

3.2.3 线性关系 以“3.1.2”项中对照品溶液的浓度为100%浓度，分别精密移取“3.1.1”项中精氨酸对照品储备液2.0、2.7、3.0、3.3、3.7、4.0、5.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀释为对照品浓度为60%、80%、90%、100%、110%、120%、150%的溶液，按“3.1.4”项衍生方法处理得衍生后溶液，分别取衍生后溶液0.4 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以氨基酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，求得线性回归方程和线性系数(相对系数r≥0.999)。结果如表5。

表5 线性回归方程

从上述结果可看出，9种氨基酸在各自的浓度范围内相关系数r=0.999，说明在设定浓度范围内，线性关系符合规定。

3.2.4 溶液稳定性 取供试品溶液，按“3.1.4”项衍生方法处理得衍生后溶液，分别在0、1、2、4、8、12，18、24 h时间点进样1次，计算各个时间点峰面积的RSD(可接受标准：RSD%≤2.0%)。测定结果表明，样品中9种氨基酸的峰面积RSD为0.6%～1.8%,说明测定溶液在24 h内稳定。

3.2.5 加样回收率 对照品溶液的制备：精密称取相应的氨基酸对照品适量(相当于异亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。以“3.1.2”项中对照品溶液的浓度为100%浓度。80%浓度溶液的制备：精密称取精氨酸原料药(相当于异亮氨酸12 mg)约8.0 mg及辅料各约53.70 mg，各3份，分别置于3个100 mL容量瓶中，用适量水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成3份80%浓度的溶液。同法，配制得到苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、盐酸赖氨酸的80%浓度的溶液。同法，配制得到各氨基酸的100%、120%浓度样品。

对照品溶液及80%、100%、120%浓度溶液按“3.1.4”项衍生方法处理得衍生后溶液，分别取衍生后溶液0.4 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算结果：精氨酸9份平均回收率与RSD分别为：99.10%，1.50%；苏氨酸9份平均回收率与RSD分别为：102.70%，1.10%；缬氨酸9份平均回收率与RSD分别为：101.70%，1.50%；甲硫氨酸9份平均回收率与RSD分别为：103.20%，0.80%；异亮氨酸9份平均回收率与RSD分别为：102.50%，0.20%；亮氨酸9份平均回收率与RSD分别为：104.90%，0.80%；苯丙氨酸9份平均回收率与RSD分别为：103.2%，1.6%；色氨酸9份平均回收率与RSD分别为：102.70%，1.70%；盐酸赖氨酸9份平均回收率与RSD分别为：101.10%，1.80%。

结论：样品溶液中每种氨基酸各浓度平均回收率都在99.1%～104.9%范围内，回收率RSD为0.2%～1.8%，因此加样回收率符合规定。

4 含量测定方法对比

4.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：254 nm；柱温：36 ℃；进样量：4 μL；流速：1.0 mL/min；流动相A：0.1 mol/L醋酸钠溶液(用冰醋酸调整pH至6.50)-乙腈(93∶7)，流动相B：乙腈-水(4∶1)；梯度洗脱程序见表6。

4.2 溶液配制

4.2.1 对照品溶液的制备 精密称取相应的氨基酸对照品适量(相当于异亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

表6 HPLC法梯度洗脱程序

4.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下内容物中的白色、红色、咖啡色颗粒，研细，精密称取适量(相当于异亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

4.3 试验过程 分别依据上述HPLC法及“2.2”项中UPLC法的色谱条件，各取对照品溶液分别进样3针，记录每种氨基酸面积。样品溶液配制2份平行样，共进样3针。计算校正因子，样品含量应该为标示量的85.0%～115.0%。

4.4 测定结果 见表7。

表7 UPLC和HPLC法含量测定结果对比

F检验结果为0.19～0.71，即F

5 讨论

以上方法学考察项目的各个结果均在可接受标准范围内。结果显示，用UPLC法、HPLC法测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸的含量，结果均在90%～110%之间，两种方法分析结果无明显差异。因此，UPLC法可用于测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸的含量能提高分析速度，节约检测成本。

采用HPLC法测定复方氨基酸胶囊(9-5)中氨基酸的含量分析时间为40 min，然而采用建立的UPLC法测定，只需要10 min，节省了30 min。同时，本文通过实验摸索，对进样体积、二元梯度的时间以及比例等进行了优化，运用优化后的色谱条件使异亮氨酸和亮氨酸的分离度达到了要求，解决了采用HPLC法测定时存在的问题，也使异亮氨酸和亮氨酸的含量测定值更加准确。且样品分析时间缩短30 min，大大减少了溶剂的使用，降低了人工成本，节省了开支。

UPLC法建立的整个实验过程中，出现了同一样品连续进2针，氨基酸的峰面积有较大偏差的问题，经过讨论，通过延长洗柱塞杆的时间后，问题得到解决。因复方氨基酸胶囊(9-5)中含9种氨基酸及衍生方法的特殊性，对检验人员的前处理提出更高的要求。

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Measuring the content of amino acid in compound amino acid capsules(9-5)by establishing the method of UPLC

WENG Yan1,LIU Li-na2,ZHOU Xiao-yan2,CHEN Jie-liang3

(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,China;2.Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanjing 210038,China;3.China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective Optimal method of UPLC was established to measure the content of amino acid in compound amino acid capsules by detailed investigation of Chromatographic parameters.Methods Nine kinds of amino acids were external standard,with phenyl isothiocyanate as the derivatization agent.Use ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm× 100 mm,1.7 μm) column.The mobile phase A was 0.1 mol/L sodium acetate solution (adjusted with acetic acid to pH 6.50 )-acetonitrile (93∶7);and acetonitrile-solution(4∶1) was the mobile phase B.The detection wavelength was 254 nm;the flow rate was 0.45 mL/min;the column temperature was 36 ℃.Results The peak time of nine kinds of amino acids in Compound amino acid capsule (9-5) was the same as that of reference substance.There was no interference for other ingredients.RSDof instrument precision was 0.5%～1.2%,and intermediate precisionRSDwas 1.3%～1.9%;there was a good linear relationship of nine kinds of amino acids in different concentrations (r≥0.999);the stability of solutionRSDwas 0.6%～1.8%;the average recovery of each kind of amino acid rate was 95.0%～105.0%.There was no obvious difference between the method of UPLC and HPLC based on the content determination.UPLC improved the speed of analysis significantly.Conclusion The method of UPLC can be used for measuring the content of amino acid in compound amino acid capsules(9-5),which is efficient and accurate.

Phenyl isothiocyanate；Compound amino acid capsules(9-5)；UPLC；Amino acid；Methodology validation

2016-06-26

1.南京中医药大学附属医院，南京 210029；2.南京圣和药业有限公司，南京 210038；3.中国药科大学，南京 210009

10.14053/j.cnki.ppcr.201702021