李 霞，王 毅，魏谭军，程阔菊

HPLC波长切换法同时测定理气散结颗粒中4个成分的含量

李 霞，王 毅*，魏谭军，程阔菊

目的 建立同时测定理气散结颗粒中氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮的HPLC波长切换联合梯度洗脱法。方法 采用Venusil MP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～15 min，12.0% A；15～31 min,12.0% A→26.0% A;31～39 min,26.0% A→40.0% A;39～45 min,40.0% A→12.0% A)，流速0.9 mL/min，波长切换(0～31 min，在230 nm波长下检测氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷；31～45 min，在242 nm波长下检测α-香附酮)，柱温30 ℃，进样量为20 μL。结果 氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮4个成分的质量浓度分别在5.15～103.00 μg/mL(r=0.999 6)、8.99～179.80 μg/mL(r=0.999 5)、19.83～396.60 μg/mL(r=0.999 9)、6.35～127.00 μg/mL(r=0.999 3)呈良好线性关系；平均加样回收率及相应的RSD(n=6)分别为96.83%(0.93%)、97.85%(1.31%)、99.71%(0.80%)、98.77%(1.59%)。结论 所建立的方法灵敏度高、快速、专属性好、准确度高，为理气散结颗粒的质量控制提供了依据。

理气散结颗粒；氧化芍药苷；芍药内酯苷；芍药苷；α-香附酮；波长切换；中成药多组分测定

0 引言

理气散结颗粒是我院的医院制剂，该制剂由白芍、香附、柴胡、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎和当归10味中药材加工而成，具有理气调血、散结止痛的功效。白芍养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳，为方中君药，其主要成分为氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷[1]；香附疏肝解郁、理气宽中、调经止痛，为方中臣药，其主要成分为α-香附酮[1]。原标准仅规定了性状及理化鉴别，无其他检测项目，难以全面有效地控制本品的质量。

本文对方中白芍的指标性成分氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷，香附的指标性成分α-香附酮采用HPLC波长切换联合梯度洗脱法同时进行了测定，为有效控制理气散结颗粒的质量、确保临床用药的安全有效，提供了试验依据。

1 仪器与试药

Agilent1100系列四元梯度泵高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BS224S电子天平(德国赛多利斯公司)；820HTS型超声波清洗机(郑州渤锐超声波设备有限公司)。

氧化芍药苷对照品(39011-91-1，纯度98.0%)购于上海道壹生物科技有限公司；芍药内酯苷对照品(39011-90-0，含量98.0%)购于上海纯优生物科技有限公司；芍药苷对照品(110736-201539，含量96.4%)、α-香附酮对照品(110748-201513，含量99.7%)均购于中国食品药品检定研究院；理气散结颗粒(每袋装15 g，批号：20151125、20151126、20151127)来源于达州市中西医结合医院制剂室；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱[2-7](0～15 min，12.0% A；15～31 min,12.0% A→26.0% A;31～39 min,26.0% A→40.0% A;39～45 min,40.0% A→12.0% A)；0～31 min时在230 nm[8-10]波长下检测氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷，31～45 min在242 nm[11]波长下检测α-香附酮；流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃；进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮对照品各适量，分别置于20 mL量瓶中，用稀乙醇溶解并稀释至刻度，即得各单一成分对照品储备溶液(氧化芍药苷0.515 mg/mL、芍药内酯苷0.899 mg/mL、芍药苷1.983 mg/mL、α-香附酮0.635 mg/mL)。再分别依次量取上面的各对照品储备液：2.0、5.0、5.0和1.0 mL，置于同一50 mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取理气散结颗粒适量，取约4.0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入稀乙醇适量，超声提取(超声功率为240 W，频率为40 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按理气散结颗粒的处方，分别制备不含白芍的阴性样品和不含香附的阴性样品，按“2.2.2”项的方法制成相应的阴性样品溶液。

2.3 专属性考察 精密吸取“2.2.1”～“2.2.3”项制备的溶液各适量，按照“2.1”项色谱条件进行检测。试验结果显示，各阴性样品溶液的色谱图中，在所测氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮4个成分对应的位置无干扰，理论塔板数按芍药苷计不低于2 500。色谱图见图1。

图1 溶液色谱图

2.4 线性范围考察 分别精密吸取“2.2.1”项对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，将其置于10 mL量瓶中并用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到一系列浓度的混合对照品溶液，按照上述测定方法进行测定，采用质量浓度X作为横坐标，测得的峰面积Y作为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程,见表1。

2.5 精密度考察 取混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积，结果氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮峰面积的RSD(n=6)分别为1.12%、1.05%、0.76%和1.33%，结果表明仪器精密度良好。

表1 线性关系实验结果

2.6 重复性考察 取理气散结颗粒样品(批号：20151125)6份，按“2.2.2”项制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进行测定，分别计算氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮的含量，并计算所测组分含量的RSD，结果所测4个组分的RSD依次为1.62%、1.47%、1.39%和1.84%。结果表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性考察 取批号20151125的供试品溶液1份，在室温下放置0、2、4、8、16、24 h来评价供试品溶液的稳定性，按“2.1”项色谱条件测定，测定氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮的峰面积值，并求得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮面积的RSD分别为1.08%、0.96%、0.82%和1.11%。结果显示供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.8 加样回收率考察 取批号20151125的理气散结颗粒6份，每份约2.0 g，精密称定，分别置不同的50 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液25 mL、稀乙醇20 mL，超声提取(超声功率为 240 W，频率为 40 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为加样回收样品试液。按“2.1”项色谱条件及上述检测方法，计算4个组分的回收率及RSD，结果氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮的平均加样回收率分别为96.83%、97.85%、99.71%、98.77%，RSD分别为0.93%、1.31%、0.80%、1.59%。2.9 样品测定 取3批理气散结颗粒，按“2.2.2”项制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样测定，采用外标法计算氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和α-香附酮的含量，结果见表2。

表2 含量测定结果(mg/g)

3 讨论

3.1 样品提取方法的选择 本试验分别对样品采用加热回流、超声提取方式，结果采用超声提取效果较好，且方法简便易行；又分别采用乙醇、稀乙醇作为提取溶剂，结果稀乙醇对所测4个成分综合提取效率较高；最后对提取时间(20、30、40 min)进行了考察,最终确定样品的最佳提取方法为稀乙醇超声提取30 min。

3.2 流动相的选择 本实验同时考察了不同的流动相体系对所测各组分的分离度和峰形影响，考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.5%磷酸溶液的流动相体系，最终优选了乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相体系。

3.3 小结 理气散结颗粒原质量标准中仅规定了性状及理化鉴别，难以全面有效地控制本品的质量，本文对方中君药白芍的指标性成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷和臣药香附的指标性成分α-香附酮进行了同时测定，方法简便、准确，重复性好，对理气散结颗粒及类似复方中成药的质量控制和临床用药安全有效提供了试验依据。

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Simultaneous determination of 4 components in Liqi Sanjie Keli by HPLC wavelength switching method

LI Xia,WANG Yi*,WEI Tan-jun,CHENG Kuo-ju

(Dazhou Hospital of Integrated TCM & WM,Dazhou 635000,China)

Objective To develop a joint gradient elution HPLC wavelength switching method for determination of the content of oxypaeoniflorin,alibiflorin,paeoniflorin and α-cyperone in Liqi Sanjie Keli simultaneously.Methods The Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) chromatographic column was adopted;the mobile phase was acetonitrile (A)-0.1% phosphoric acid solution (B) with gradient elution(0～15 min,12.0% A;15～31 min,12.0% A→26.0% A;31～39 min,26.0% A→40.0% A;39～45 min,40.0% A→12.0% A),at a flow rate of 0.9 mL/min;the detection wavelengths were set at 230 nm in 0～31 min to determine oxypaeoniflorin,alibiflorin and paeoniflorin,and 242 nm in 31～45 min to determine α-cyperone;the column temperature was set at 30 ℃;sample quantity was 20 μL.Results The quality concentration of oxypaeoniflorin,alibiflorin,paeoniflorin and α-cyperone was in good linear relationship within 5.15～103.00 μg/mL (r=0.999 6),8.99～179.80 μg/mL (r=0.999 5),19.83～396.60 μg/mL (r=0.999 9) and 6.35～127.00 μg/mL(r=0.999 3) respectively.The average recoveries and the correspondingRSDwere 96.83%(0.93%),97.85%(1.31%),99.71%(0.80%) and 98.77%(1.59%),respectively.Conclusion The established method is highly sensitive and rapid with good specificity and high accuracy.It can be applied to the quality control of Liqi Sanjie Keli.

Liqi Sanjie Keli;Oxypaeoniflorin;Alibiflorin;Paeoniflorin;α-Cyperone;Wavelength switching;Multicomponent determination of Chinese patent drug

2016-06-22

四川省达州市中西医结合医院，四川 达州 635000

四川省科技支撑计划项目(2014SZ0189)

10.14053/j.cnki.ppcr.201702023

*通信作者