田 中 乐，吴 文 忠，张 春 枝，吴 迪

(1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.大连医诺生物有限公司，辽宁 大连 116600)

0 引 言

亮氨酸属于支链氨基酸，是人体必需氨基酸中的一种。L－亮氨酸的生产方法有蛋白水解法、化学合成法、酶催化法、微生物发酵法等[1]。国内L－亮氨酸的生产主要在天然蛋白水解液中提取，微生物直接发酵目前也已经有中试生产的报道[2]。工业化的L－亮氨酸需要分离提纯，一般的方法有离子交换法、沉淀法、乳状液膜法及膜分离技术法[3－4]。考虑到这些方法的处理量、纯度、成本等问题，本文着重利用酶液水解L－亮氨酸异丁酯的方法来获得高纯的L－亮氨酸产品，并通过进行正交试验对工艺参数的优化来提高L－亮氨酸收率。

1 材料与方法

1.1 主要原料、试剂

L－亮氨酸(w＞98.5%)，湖北新生源生物工程公司；L－亮氨酸异丁酯，由L－亮氨酸制得；脂肪酶粉A，来源于试验室；脂肪酶DF“天野”15、脂肪酶G“天野”50、脂肪酶A“天野”6，日本天野酶公司；胰酶，国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、无水甲酸、高氯酸、冰醋酸、无水乙醇，分析纯；甘氨酸，生化试剂。

1.2 酶液的制备

按不同pH配制缓冲液体系，将脂肪酶粉A投入到缓冲液中(m(脂肪酶粉A)／V(缓冲液)＝0.075g／mL，脂肪酶粉酶活为100 000U／g)，转子搅拌提取20min，3 000r／min离心20min，倾倒出上清液即得试验所需脂肪酶液，4℃冰箱冷藏。

1.3 L－亮氨酸的制备

称取L－亮氨酸异丁酯2.0g和适量的酶液，放置于一定温度的摇床中，用L－亮氨酸的溶解度提前饱和反应液，封口膜封口，170r／min摇床中反应，反应结束冷却至室温，过滤，无水乙醇洗涤，烘箱干燥得L－亮氨酸，称量后计算L－亮氨酸收率。

1.4 L－亮氨酸含量测定

取试验所得L－亮氨酸约0.1g，精密称定，加无水甲酸1mL溶解后加冰醋酸25mL，按照电位滴定法[5]，用高氯酸滴定液(0.1mol／L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 不同酶对L－亮氨酸异丁酯水解效果的影响

分别用3种天野脂肪酶、木瓜蛋白酶、胰酶以及脂肪酶粉A的水提酶液对L－亮氨酸异丁酯进行水解试验，反应条件为：L－亮氨酸异丁酯质量为2.0g，加入不同酶制成酶液25mL，反应前用L－亮氨酸饱和(添加的溶解度按在25℃、100mL水中的溶解度2.3g，即每25mL酶液溶解0.575g L－Leu)，46 ℃、170r／min 摇 床 中 反 应8h。由表1知，6种酶仅有胰酶及脂肪酶A对L－亮氨酸异丁酯具有水解作用。脂肪酶 A 水解L－亮氨酸异丁酯得到的L－亮氨酸收率最高，胰酶是混合酶，部分酶起作用时可能会伴随副反应，故选择脂肪酶A进行L－亮氨酸异丁酯的水解试验。

表1 不同酶对L－亮氨酸收率的影响Tab.1 Effect of different enzymes on the yield of L－leucine

2.1.2 缓冲液体系对L－亮氨酸收率的影响

在纯水及 KH2PO4－NaOH、KH2PO4－K2HPO4、Gly－NaOH缓冲液体系条件下分别对脂肪酶粉A进行溶解离心，物料比为1∶12.5，酶液先用L－亮氨酸饱和，加入L－亮氨酸异丁酯2.0g，48℃、170r／min摇床中反应8h，考察缓冲液体系对L－亮氨酸收率的影响。如表2所示，4种缓冲体系所提酶液中，Gly－NaOH缓冲液体系水解L－亮氨酸异丁酯效果最好，用纯水提取的酶液收率次之，并且反应后生成的L－亮氨酸溶液中因没有离子存在使其部分黏壁，处理较困难。选择Gly－NaOH缓冲液体系(pH 9.4)水解L－亮氨酸异丁酯。

表2 缓冲液体系对L－亮氨酸收率的影响Tab.2 Effect of different buffer systems on the yield of L－leucine

2.1.3 物料比对L－亮氨酸收率的影响

通过确定底物L－亮氨酸异丁酯的质量、改变酶液用量的方法来调整物料比。L－亮氨酸异丁酯质量为2.0g，分别加入15，18，20，25，30mL的酶液，即L－亮氨酸异丁酯与水的物料比为1∶7.5，1∶9，1∶10，1∶12.5及1∶15。酶液先用L－亮氨酸溶解度饱和，反应温度为48℃，170r／min摇床中反应8h，考察物料比对L－亮氨酸收率的影响。由图1可知，当物料比从1∶10到1∶12.5时，L－亮氨酸的收率由低到高的过程，在物料比增至1∶15时，收率增加不大。考虑到最优的酶液总量，需满足最适的底物浓度，选择L－亮氨酸异丁酯的水解反应的物料比为1∶12.5。

图1 物料比对L－亮氨酸收率的影响Fig.1 Effect of material ratio on the yield of L－leucine

2.1.4 反应时间对L－亮氨酸收率的影响

L－亮氨酸异丁酯初始被水解时，很长时间都保持油状，为了获得较为准确的数据，选择从8h开始。在L－亮氨酸异丁酯为2.0g、物料比为1∶12.5、酶液先用L－亮氨酸饱和、48℃、170r／min的条件下，考察不同的反应时间下L－亮氨酸收率。由图2可知，L－亮氨酸异丁酯在水解过程中，随着时间的增加，L－亮氨酸的收率逐渐增加，12h时收率达到89.23%。继续增加时间，L－亮氨酸收率基本不增加，所以选择最佳反应时间为12h。

图2 反应时间对L－亮氨酸收率的影响Fig.2 Effect of reaction time on the yield of L－leucine

2.1.5 反应温度对L－亮氨酸收率的影响

在L－亮氨酸异丁酯为2.0g，加入25mL的L－亮氨酸饱和后酶液，摇转速为170r／min，反应温度分别为44、46、48、50、54℃条件下反应12h，考察反应温度对L－亮氨酸收率的影响。如图3所示，在44～50℃时，L－亮氨酸收率呈增加趋势，温度到达54℃时，L－亮氨酸的收率大幅度减小。温度过低时，脂肪酶水解速率较慢，温度过高时酶容易加快变性，所以选择反应温度为50℃较合适。

图3 反应温度对L－亮氨酸收率的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on the yield of L－leucine

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交试验

根据单因素试验结果，采用L9(34)正交表，以L－亮氨酸收率为指标，因素水平和正交试验结果及分析分别见表3、4。从表3、4可以看出，影响L－亮氨酸收率的因素顺序为料液比、反应温度、反应时间，最佳的组合为C3A2B3，即料液比为1∶13，反应温度为50℃，反应时间为13h。

2.2.2 验证性试验

采用正交试验确定最佳的脂肪酶A水解L－亮氨酸异丁酯的工艺条件，以L－亮氨酸收率为指标，进行验证性试验。3个平行反应结果表明，在此条件下L－亮氨酸的收率为95.23%。

表3 正交试验因素水平表Tab.3 Level table of orthogonal exprimental design

表4 正交试验结果及分析Tab.4 Result of analysis of orthogonal exprimental

3 结 论

通过不同酶作催化剂水解L－亮氨酸异丁酯，发现脂肪酶A对L－亮氨酸异丁酯水解效果最好。通过单因素及正交试验获得了最佳的工艺参数：以L－亮氨酸异丁酯为原料，选择Gly－NaOH缓冲液体系提取脂肪酶液，用L－亮氨酸溶解度的质量饱和酶液，摇床转速为170r／min，物料比为1∶13，反应温度为50℃，反应时间13h。L－亮氨酸的收率为95.23%。对所得到的L－亮氨酸进行含量测定，测定其纯度为99.80%。该方法制备的L－亮氨酸产品色泽光亮，纯度好，L－亮氨酸收率高。

[1]刘建军，赵祥颖，田延军，等.L－亮氨酸的性质、生产及应用[J].山东食品发酵，2005(1)：3－6.

[2]李桂甫，陈宁，徐庆阳.L－亮氨酸的发酵中试生产[J].现在食品科技，2010，26(12)：1367－1369.

[3]谢希贤，曹华杰，杜军，等.采用膜分离技术高效分离提取L－亮氨酸[J].食品与发酵工业，2008，34(12)：180－182.

[4]朱澄云，莫凤奎，葛晓玲，等.乳状液膜法提取亮氨酸(Ⅱ)[J].膜科学与技术，2001，21(1)：59－61.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典：第二部[M].北京：化学工业出版社，2010：1301－1302.