陈薇娜,岳显可,,杨海燕,3*,张方坤

延胡索酸碱水提物中生物碱含量比较

陈薇娜1,岳显可1,2,杨海燕1,3*,张方坤2

目的 比较不同浓度酸碱水溶液对延胡索中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱6个生物碱提取的影响。方法 用氨水、冰醋酸配制不同酸碱浓度水溶液，供试品加热回流提取；采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，乙腈-0.6%醋酸溶液(pH 5.0)为流动相进行梯度洗脱，检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1 mL/min，测定6个生物碱及总生物碱含量。结果 原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱分别在14.34～143.36、12.61～126.07、12.80～128.01、12.22～122.16、15.31～153.14、11.41～114.09 μg/mL内呈良好线性关系，R2≥0.999 0；平均加样回收率分别为99.31%、97.64%、101.41%、96.29%、99.63%、98.74%，RSD值均小于3.0%。结论 延胡索不同酸碱提取物生物碱含量有较大差异，酸性提取物生物碱含量均高于碱性提取物。

延胡索；酸碱水溶液；生物碱

0 引言

延胡索为罂粟壳植物延胡索Corydalis yanhusuo的干燥块茎，别名元胡。在传统医学中有两千多年的历史，用于胸痹心痛、脘腹疼痛、腰痛、疝气痛、痛经、闭经、产后瘀滞腹痛、跌打损伤等[1]，为中药复方制剂中的常用药。延胡索主要含有生物碱成分，即延胡索甲素、乙素、丙素等20个生物碱[2]。在心血管系统方面有扩张冠脉血管[3]、抗心律失常[4]、保护心肌细胞作用[5]，在神经系统方面具有镇痛[6]、镇静作用，在消化系统方面有抗溃疡[7]、抑制胃液分泌，还具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、提高应激能力的作用。

延胡索历来多以其醋制品入药，醋制能使难溶于水的生物碱与醋结合成为易溶于水的醋酸盐，从而增加延胡索在水煎液中的总生物碱含量[8]。然而现有研究主要集中在不同产地延胡索、醋制延胡索，或者是延胡索炮制前后的质量差异，很少对生延胡索在不同浓度酸碱溶剂中生物碱含量的分布进行研究。本实验首次以延胡索中的原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱的提取率为指标[9-10]，比较不同酸碱水溶液中各生物碱含量的分布情况。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1200型高效液相色谱仪，配有DAD二极管阵列检测器，Chemstation色谱工作站(美国安捷伦公司)；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 μm×250 mm,5 μm)色谱柱；AL-204电子分析天平(梅特勒仪器有限公司)；TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；W201B恒温水浴锅(上海申胜生物科技有限公司)；DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药 新鲜延胡索药材采自金华东阳，经切片，烘干为生延胡索片；原阿片碱(批号：110853-201003，纯度99.9%)、盐酸巴马汀(批号：110732-201108，纯度86.2%)、盐酸小檗碱(批号：110713-200910，纯度97.9%)、延胡索乙素(批号：110726-201112，纯度99.6%)购自中国食品药品检定研究院，去氢紫堇碱(批号：141207，纯度98.12%)、紫堇碱(批号：150327，纯度98.56%)购自成都普非德生物技术有限公司；氨水、冰醋酸、甲醇、磷酸、三乙胺为分析纯，液相用甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 本研究采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱，乙腈为流动相A，0.6%醋酸溶液(三乙胺调pH至5.0)为流动相B，进行梯度洗脱，0～50 min，15%～50% A；50～70 min，50%～80% A；70～75 min，80% A；检测波长为280 nm，流速1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量10 μL。延胡索对照品及样品色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品原阿片碱5.74 mg、盐酸巴马汀5.85 mg、盐酸小檗碱5.23 mg、去氢紫堇碱4.98 mg、延胡索乙素6.15 mg、紫堇碱4.63 mg置于20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，溶解摇匀，制成含原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱浓度分别为286.71、252.14、256.01、244.32、306.27、228.17 μg/mL的混合溶液，作为对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备 称取延胡索粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，于具塞三角锥形瓶中，精密加入水50 mL，称定重量，冷浸1 h后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25.0 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5.0 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 线性关系考察 取“2.2”项下对照品储备液0.5、1、2、4、5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列对照品混合溶液。按“2.1”项下色谱条件依次进样分析，记录色谱峰面积。以对照品混合溶液的浓度(X，μg/mL)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：原阿片碱Y=0.296 5X-0.008 8(R2=0.999 6)；盐酸巴马汀Y=0.547 7X-0.646 2(R2=0.999 7)；盐酸小檗碱Y=0.460 8 X+0.447 4(R2=0.999 7)；去氢紫堇碱Y=0.452 3X+0.450 9(R2=0.999 8)；延胡索乙素Y=0.276 4X+0.113 7(R2=0.999 8)；紫堇碱Y=0.350 6X+0.364(R2=0.999 8)。线性范围分别为14.34～143.36、12.61～126.07、12.80～128.01、12.22～122.16、15.31～153.14、11.41～114.09 μg/mL。

图1 延胡索混合对照品与延胡索样品色谱图

2.5 精密性考察 精密吸取混合对照品溶液(原阿片碱57.34 μg/mL、盐酸巴马汀50.43 μg/mL、盐酸小檗碱50.20 μg/mL、去氢紫堇碱48.86 μg/mL、延胡索乙素61.25 g/mL、紫堇碱45.63 μg/mL)对照品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样测定6次，结果显示，峰面积RSD分别为1.35%、1.14%、1.72%、1.08%、0.12%、0.74%，表明仪器精密性良好。

2.6 加样回收率试验 称取已知含量延胡索粉末(过三号筛)6份，每份约0.5 g，加入原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱对照品适量，按“2.3”项下方法制备样品，按“2.1”色谱条件进行测定，计算回收率。原阿片碱平均回收率为99.31%、RSD=1.38%，盐酸巴马汀平均回收率为97.64%、RSD=1.85%，盐酸小檗碱平均回收率为101.41%、RSD=1.84%，去氢紫堇碱平均回收率为96.29%、RSD=1.61%，延胡索乙素平均回收率为99.63%、RSD=1.18%，紫堇碱平均回收率为98.74%、RSD=1.36%。

2.7 稳定性试验 取延胡索供试品溶液，分别于0、4、8、12、16 h，按“2.1”项下色谱方法进行分析。原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱峰面积值RSD值分别为0.83%、1.29%、0.98%、1.02%、0.83%、1.53%，结果表明，供试品溶液在16 h内稳定。

2.8 重复性考察 取同一批延胡索粉末约0.5 g，共6份，按照“2.3”项下制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行分析测定。结果显示，原阿片碱平均含量0.171 mg/g、RSD为1.43%，盐酸巴马汀平均含量0.168 mg/g、RSD为1.36%，盐酸小檗碱平均含量0.059 mg/g、RSD为1.64%，去氢紫堇碱平均含量0.747 mg/g、RSD为1.26%，延胡索乙素平均含量0.411 mg/g、RSD为1.81%，紫堇碱平均含量0.751 mg/g、RSD为1.23%，结果表明，重复性良好。

2.9 延胡索酸碱水提物中生物碱含量比较 取金华东阳(YH160601)、磐安(YH160602)、丽水庆元(YH160603)3批产地鲜切延胡索片，各称取延胡索粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，于具塞三角锥形瓶中，分别精密加入8.0%、4.0%、2.0%、1.0%、0.5%醋酸溶液，水，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%氨水溶液50 mL，称定重量，冷浸1 h后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用相应溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25.0 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5.0 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。按“2.1”项下色谱条件进行测定，得6个生物碱含量及总和，见表1。

为更加直观地观察延胡索不同酸碱水提物中生物碱含量的变化趋势，以各浓度酸碱水溶液为横坐标，各批次延胡索中原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱含量的平均值为纵坐标作柱形图，见图2。

表1 延胡索不同酸碱水提物生物碱含量比较(mg/g)

由表1、图2可见，延胡索酸性提取物中，生物碱含量均高于水及碱性提取物。8.0%醋酸溶液提取时生物碱含量最高，随着醋酸浓度的降低，生物碱含量也相应减低；延胡索水提物生物碱含量高于碱性提取物，说明碱性条件抑制生物碱的提取；然而，由图2可知，0.5%氨水溶液提取时，生物碱含量最低，随着碱性的逐渐增大，生物碱含量先增高，而后又减低。

图2 延胡索不同酸碱溶剂提取物中6个生物碱含量比较

3 讨论

用DAD检测器对原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素、紫堇碱在200～400 nm波段进行扫描，当检测波长为280 nm时，6个待测成分均有较大紫外吸收，响应高且分离效果良好，故选用280 nm为检测波长较为理想。

延胡索为临床常用药，明确含延胡索的方剂182首，配伍常用药物共435味，涉及主治疾病78种。由于延胡索中游离生物碱难溶于水，其临床应用时往往使用醋制延胡索，经醋制后，其生物碱与醋酸结合成易溶于水的醋酸盐，从而更好地发挥药效，这也是醋制入肝、疏肝止痛的原理。然而，在全国范围内，延胡索醋制方法和工艺有较大区别，导致醋延胡索质量差异较大。从本研究中可知，生延胡索在醋酸溶液中生物碱的提取效果较好。本课题还将继续开展生物等效性评价，明确生延胡索酸提和醋延胡索水提的药效区别。

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Comparison of the contents of alkaloids inRhizomacorydalisextractive in acid and alkali aqueous solution

CHEN Wei-na1,YUE Xian-ke1,2,YANG Hai-yan1,3*,ZHANG Fang-kun2

(1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Mecical Pieces,.LTD,Hangzhou 311401,China;3.Hangzhou Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China)

Objective To compare the contents of 6 alkaloids(protopine,palmatine hydrochloride,berberine hydrochloride,dehydrocorydaline,tetrahydropalmatine and corydaline) fromRhizomacorydalisextractive extracted by different concentrations of acid and alkali aqueous solution.Methods Different concentrations of acid and alkali aqueous solution was made by ammonium hydroxide and acetic acid.Test solution was prepared by heating reflux.The optimal conditions of separation and detection were achieved on a Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) with linear gradient elution of acetonitrile-0.6% acetate solution (pH 5.0).The detection wavelength was 280 nm,the column temperature was 25 ℃,and the flow rate was 1 mL/min.Six alkaloids and total alkaloids of the solution were detected.Results All the active constituents′ calibration curves showed a good linearity,the liner range of the active constituents was 14.34～143.36,12.61～126.07,12.80～128.01,12.22～122.16,15.31～153.14,and 11.41～114.09 μg/mL,R2≥0.999 0,respectively.The average recovery was 99.31%,97.64%,101.41%,96.29%,99.63% and 98.74%,RSD<3.0%.Conclusion The contents of alkaloid inRhizomacorydaliswhich are extracted by alkali aqueous solution are higher than by acid aqueous solution,which has a significant difference.

Rhizomacorydalis;Acid and alkali aqueous solution;Alkaloid

2016-06-29

1.浙江中医药大学,杭州 310053;2.浙江中医药大学中药饮片有限公司,杭州 311401;3.杭州市中医院,杭州 310006

杭州市卫生科技计划(一般)项目(2015A39)

10.14053/j.cnki.ppcr.201702022

*通信作者