周萍邵巧云赵焕徐权华陈佳玮胡福良

（1杭州蜂之语蜂业股份有限公司，桐庐311500；2浙江大学动物科学学院，杭州310058）

湿法消化法测定蜂花粉中铅的研究

周萍1邵巧云1赵焕1徐权华1陈佳玮2胡福良2

（1杭州蜂之语蜂业股份有限公司，桐庐311500；2浙江大学动物科学学院，杭州310058）

本文建立了湿法消化-原子吸收光谱法测定蜂花粉中铅的方法。实验优化表明，最佳消化程序为：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6~10 h（至溶液变浅黄）；石墨炉最佳温升：干燥温度120℃，灰化温度500℃，原子化温度1900℃，清残余温度2200℃；最佳称样量0.25 g～0.30 g。该方法条件下，线性范围在5~80 ng/ml之间，线性方程为y= 0.0024x-0.0009，R2=0.9988，线性关系良好。方法回收率在95.2~100.1%之间，n=3。精密度RSD为3.05%，n=6。结合实际检测结果，为GB 2762蜂花粉中铅的指标限量提出了合理指标建议。

蜂花粉；铅；测定方法；限量要求

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物质[1]，广泛用于医药、食品和日化用品行业。由于重金属铅是蓄积性毒物，其污染可以通过食物链传递、富集和放大，长期摄入可导致人体慢性中毒[2，3]。为了加强蜂花粉作为食品、药品使用的安全性和质量标准控制，我国规定蜂花粉中铅的限量要求是0.5 mg/kg[4]。自2013年以来，我国政府监管机构通过市场抽查的方式，对蜂花粉产品进行铅的检测，已经有多家企业的产品被检测到铅的含量超过了限量要求。

目前蜂花粉中铅的检测方法主要有：电感耦合等离子体原子发射光谱法[5-8]，电感耦合等离子体质谱法[9，10]，原子吸收分光光度法[11-14]。其中，电感耦合等离子体原子发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法能够同时进行多种元素分析，但是仪器昂贵。原子吸收分光光度法作为经典的铅检测方法，具有灵敏度高、准确性好等特点。检测蜂花粉中的铅时，文献多采用微波消解、干法消化等样品前处理技术，微波消解仪虽然有消解时间短、铅损失小的优点，但是仪器的价格不菲，而干法消化需要高温马弗炉，大多不能一次消化完全，操作繁琐又不方便，铅也有不同程度损失。湿法消化步骤虽稍繁琐，却操作简单，成本低廉，准确度高，仪器简单，适合大多数企业使用。由于现有检测标准方法未细化湿法消化条件、最佳称样量和最佳石墨炉加热程序，故没有得到很好的应用。本文依据GB 5009.12食品中铅的测定标准方法，研究了蜂花粉样品的湿法消化升温程序、最佳称样量、消化总时间、基体改进剂添加量对检测结果的影响，确定了简单实用的湿法消化前处理方法和石墨炉升温程序，同时对蜂花粉中铅进行测定，结果显示该方法效果良好。

由于蜂花粉中铅超过GB 2762规定的限量要求而被通报和处理的现象时有发生，为此，本文还对蜂花粉中铅的现状进行了综合分析，并提出合理的蜂花粉中铅的限量建议，供今后修订GB 2762时参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铅标准品（1 mg/ml，中国药品生物制品检定所）；磷酸二氢铵为分析纯；硝酸、高氯酸均为优级纯；双重蒸馏水。

0.5 mol/L硝酸溶液：取3.2ml硝酸加入50ml水中，稀释至100ml。

磷酸二氢铵溶液（80 g/L）：称取8.0 g磷酸二氢铵，以水溶解稀释至100ml。

混合酸：硝酸+高氯酸（9+1），取9份硝酸与1份高氯酸混合。

实验样品：油菜蜂花粉、茶花花粉、荷花花粉（杭州蜂之语蜂业合作社、江山健康食品有限公司提供），精制花粉颗粒，批号：20150113（杭州蜂之语蜂业股份有限公司提供）。

1.2 仪器与设备

北京普析通用仪器有限责任公司TAS-990石墨炉原子吸收分光光度计；Sartorius BS224S分析天平；LICHEN邦西仪器科技（上海）有限公司DB-1EFS智能石墨电热恒温加热板。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取经过研磨的试样0.25~0.30 g（精确到0.0001 g）于高型石英烧杯中，放数粒玻璃珠，加8ml混合酸，加盖浸泡过夜，上加一无柄小漏斗（下部孔径0.5cm），置于电热板上加热消解，加热程序：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6～10 h（至溶液变浅黄色），控制消化温度不超过180℃，液体呈微沸状态。当样液体积减少至1~ 2ml时，消化液应呈透明的无色或浅黄色，即是消化完全状态。当液体少于2ml且消化尚未完全时，则需补加混合酸2ml，继续至消化完全。取下放冷，用塑料滴管将消化液洗入10ml容量瓶中，用水少量多次洗涤高型石英烧杯，定容混匀备用；同时做试剂空白及添加回收。

1.3.2 标准溶液及标准曲线制备

铅标准储备液：1 mg/ml，4℃下保存，36个月有效。

铅标准中间液：每次吸取铅标准储备液1.0ml于 10ml容量瓶中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）至刻度，配制成0.1 mg/ml中间标准液（1ml分装于1.5ml塑料离心管中，4℃下保存，12个月有效）。

铅标准临时标准液：分别吸取铅标准中间液100μl于1.5ml塑料离心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，摇匀，配制成0.01 mg/ml临时标准1液。

吸临时标准1液100μl于1.5ml塑料离心管中，加入硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，用移液枪冲匀，配制成0.001 mg/ml临时标准2液，做添加之用。

吸临时标准1液100μl于10ml塑料离心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，重复1次，摇匀，配制成2ml 0.0001 mg/ml临时标准3液。

铅标准使用液：分别吸临时标准3液100μl、200μl、400μl、800μl于1.5ml塑料离心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl、800μl、600μl、200μl，分别摇匀，再用移液枪冲匀，配制成每ml含10.0，20.0，40.0，80.0 ng铅的标准使用液（可根据样品所含浓度调整配制），取20.0 ng/mL的标准液250μl，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）750μl，摇匀，成为每毫升含5.0 ng铅的标准使用液，从而配制成5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 ng铅的系列标准使用液。同1.3.3样品测定方法，测定铅的系列标准使用液的吸光度，以吸光度为纵坐标，铅标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 样品测定

1.3.3.1 原子吸收分光光度计参数设定

通过对管理理念进行创新，能够有效的提升公路工程施工效率。在竞争激烈的工程行业当中，面对日新月异的变化，过去传统的施工管理理念与施工技术已经很难适应时代的发展要求，因此，要想让企业在竞争中能够继续生存和发展，就要转变观念，根据当前公路工程施工管理与施工技术中面临的问题，结合企业自身发展，创新和完善管理理念，进而推动企业的健康发展。

根据仪器性能及说明书调至最佳状态，见表1。

表1 原子吸收分光光度计铅测定仪器条件

1.3.3.2 样品测定

含基体改进剂：分别吸取样液和试剂空白液各800μl，加入200μl基体改进剂-磷酸二氢铵溶液（80 g/L），混合30 s，移液枪冲匀，吸取12.5μl注入石墨炉，测得其吸光度。

不含基体改进剂：分别吸取样液和试剂空白液10.0μl注入石墨炉，测得其吸光度。

以上结果，代入标准系列的一元线性回归方程（1.3.2）中求得样液中铅含量，计算结果保留两位有效数字。

2 结果与分析

2.1 消化条件的优化

2.1.1 消化程序的选择

在湿法消化过程中，铅离子与其他溶液中的阴离子结合形成铅盐，在一定温度下，仍然存在铅损失的风险，为了确定消化最高温度，特选取140℃、160℃、180℃、200℃、220℃对样品进行消化，均消化至溶液呈透明浅黄色或者无色，并冒白烟，总消化时间不超过11.5 h，用蒸馏水定容至10ml，测定样液吸光度，结果见图1。

图1 不同最高消化温度对吸光度的影响

市售浓硝酸的沸点约为121℃，纯高氯酸的沸点是130℃，故不能快速升温消化，将消化程序设定电热板初始温度为70℃。经过试验观察，随着温度升高，样品开始冒棕色烟雾，70℃0.5 h后，样液反应趋于平缓，再设定加热板温度为140℃，随着温度升高，样品又开始冒棕色烟雾，0.5 h后，样液反应趋于平缓，为保证该温度下的反应完全，继续加热0.5 h后将加热板温度调至最高的消化温度，保持至反应结束。从图1可以看到，当最高消化温度为180℃时，吸光度最高。故选择最佳消化程序为：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6~10 h。

消化时间与称样量关系非常大，由于蜂花粉中铅的限量要求为0.5 mg/kg，故设定称样量为0.25 g，0.30 g,0.40 g，0.45 g和0.50 g，分别按确定的消化程序进行消化，发现当称样量为0.25 g，0.30 g时，能够在规定的时间内消化完全，而0.40 g，0.45 g和0.50 g的样液仍然是棕色的，表示消化没有完全。故选择最佳称样量为0.25～0.30 g。当称量为0.25 g时，按本文的检测方法，蜂花粉中铅的定量限为0.2 mg/kg，可以满足日常生产的监控要求。

2.1.3 消化时间的选择

不同的蜂花粉样品，由于成分相对存在差异，所以消化时间也不尽相同。特别地，对油菜花粉进行消化总时间的考察，发现消化8 h后，反应已经完全，180℃下继续消化1，2，3，4小时后，用蒸馏水定容至10ml，测定样液吸光度，结果见图2。

图2 不同消化总时间对吸光度的影响

由图2可知，在本消化程序条件下，消化总时间在12 h内，对吸光度无显著影响。

2.2 灰化温度的选择

2.2.1 无基体改进剂时的灰化温度

石墨炉加热程序直接影响检测结果，由于铅容易挥发，故灰化阶段的温度为关键控制点，干燥温度直接关系到灰化是否彻底，灰化温度则关系到试样是否灰化完全及铅的损失大小。为保证样液干燥彻底，干燥温度为120℃/15 s，保持15 s。设定10 s内达到灰化温度400℃、500℃、600℃、700℃、800℃，保持15 s，其他条件参考仪器使用说明书，测定吸光度。结果：500℃时，吸光度最大，故选择灰化温度为500℃。

2.2.2 有基体改进剂时的灰化温度

基体改进剂可提高铅的灰化温度，排除其他元素的干扰，样品中当某种元素含量特别高时，尤其适用。本文以GB 5009.12中提到的基体改进剂磷酸二氢铵，配制成80 g/L浓度，如2.2.1研究了样品最佳灰化温度为800℃。

2.3 方法稳定性

精密称取样品（精制蜂花粉颗粒，杭州蜂之语蜂业股份有限公司生产，批号：20150113）0.25 g，添加2 μg/ml铅标准溶液125μl，按1.3.1要求对样品进行操作处理，在室温下，分别在0，1，2，4，6，8 h按1.3.3方法测定，记录其吸光度，RSD=3.77%（n=6），符合GB/T 27404对检测结果精密度的要求，表明处理后的样液在6 h内稳定性良好。

2.4 方法的线性范围、回收率和精密度

按本方法进行测定，线性范围：5.0 ng/ml～80.0 ng/ml，线性方程：y=0.0024x-0.0009，R2=0.9988，线性关系良好。取批号为20150113的精制蜂花粉颗粒样品，进行6次平行试验，RSD=3.05%，表明本方法精密度良好，符合GB/T 27404关于精密度的要求。称取0.25 g批号为20150113的精制蜂花粉颗粒样品，添加2 μg/ml铅标准溶液125μl（添加浓度1 mg/kg），进行添加回收试验，试验结果：样品回收率95.2～100.1%（n=3），表明本方法准确度良好，符合GB/T 27404关于准确度的要求。

2.5 蜂花粉中铅的测定

检测了市场上常见的蜂花粉：油菜蜂花粉、茶花花粉、荷花花粉和精制花粉颗粒中的铅含量，蜂花粉样品随机采购，未考虑地域、时间的限制，检测结果如表2。

表2 蜂花粉中铅的测定结果

总共检测了7个样品，合格率43%，与文献报道的结果基本一致。

3 蜂花粉中铅的限定建议

据中国蜂产品协会蜂花粉专业委员会的业内专家说，我国蜂花粉中铅含量有40%～60%大于GB 2762中关于蜂花粉铅限量的值。何燕等[5]调查了14种来自于不同产地的71个花粉样品，结果铅含量大于0.5 mg/kg的样品有43个，占总数的61%。浙江大学杨开等[7]对12种花粉中的铅进行了测定，结果大于0.5 mg/kg的占50%，最大值为4.77 mg/kg。曾志将等[8]检测了除常规蜂花粉外的14种其他粉源植物蜂花粉中的铅含量，结果大于0.5 mg/kg的样品有9个，占总数的64%。这些文献的报道与业内专家的说法一致。

我们又调查了蜂蜜中关于铅的限量，GB 2762中规定铅限量为1 mg/kg。2013年，安徽国家农业标准化与监测中心的夏春、高柱、臧爱香，用微波消解-电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定了4种常见蜂蜜中的多种元素[15]，结果铅含量为0.005～0.03 mg/kg，中国农业科学院陈兰珍等[16]测定了6种蜂蜜中的微量元素和重金属，结果铅含量为0.014～0.031 mg/kg，远低于GB 2762中规定的铅限量1 mg/kg。因此，我们对GB 2762中规定铅限量的依据存在疑问。

曾志将等[11]对花粉和蜂蜜两者中矿物质含量进行了相关性分析，结论是蜂花粉是蜂蜜中铅的重要来源，而GB2762中关于蜂花粉、蜂蜜铅限量却是倒置的，规定了蜂花粉中铅限量为0.5 mg/kg，蜂蜜却是1 mg/kg，与实际检测结果明显不符。蜂花粉可作为保健食品原料，在GB 16740保健食品中，保健食品中铅的限量是2.0 mg/kg。故目前GB2762关于蜂花粉的铅限量的设定与实际情况脱离，也无科学性，一定程度上制约着行业的发展。

以上分析意味着，如果不对蜂花粉原料进行铅限量的控制，那么蜂花粉中铅超标的可能性高达60%，这对于蜂花粉行业的发展是极其不利的，有关标准制订部门、政府监管部门应该对此事加以重视。

综上所述，建议相关标准起草单位和起草人，参考GB 16740确定蜂花粉中的铅限量要求为2 mg/kg。

[1]GB/T 30359-2013蜂花粉[S].2013.

[2]段明革，马会国，郎明林.微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定蔬菜中微量铅和镉[J].中国卫生检验杂志,2006,16(11): 1350-1351.

[3]陆龙根.植物类中药材中砷、镉和铅的含量及安全性评价[J].微量元素与健康研究,2003,20(1):51-52.

[4]GB 2762-2012食品安全国家标准食品中污染物限量[S]. 2012.

[5]何燕，曹丽玲，王可，等.ICP-AES法分析蜂花粉中10种金属元素及含量调查[J].医学动物防制,2011,27(3):255-259.

[6]杨立学，赵川，陈淑玲.ICP-AES测定花粉中10种微量元素的方法研究[J].职业与健康,2010,26(12):1357-1358.

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[8]曾志将，颜伟玉.花粉中矿物质研究[J].中国蜂业,2002,53(4): 9-11.

[9]周小玲，王永宁，石玉平.微波消解-ICP-MS测定青海油菜蜂花粉中微量元素[J].光谱实验室,2010,27(3):1181-1184.

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[12]陈良璧，阎永贤，周万森.基体改进效应用于测定花粉中痕量铅、镉的石墨炉原子吸收法研究[J].光谱学与光谱分析,1986,7 (3):63-66.

[13]张萍，卢俊杰.微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定蜂花粉中铅、镉和铜[J].光谱实验室,2012,29(3):1416-1419.

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[15]夏春，高柱，臧爱香.用微波消解-电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定蜂蜜中的多种元素[J].现代农业科技,2013(2): 278-279.

[16]陈兰珍，芮玉奎，赵静，等.应用ICP-MS测定不同种类蜂蜜中的微量元素和重金属[J].光谱学与光谱分析,2008,28(6): 1403-1405.

Determination of lead in bee pollen by wet digestion method

Zhou Ping,Shao Qiaoyun,Zhao Huan,Xu Quanhua,Chen Jiawei,Hu Fuliang
(1 Hangzhou Beewords Apiculture Co.Ltd.,Tonglu 311500,China;2 Animal Science College of Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

A wet digestion atomic absorption spectrometry method was established for the determination of lead in bee pollen.The results showed that the optimal extracting technological conditions were as follows:the best digestion procedures used for 70℃→0.5 h,140℃→1 h,180℃→6~10 h(until solution became pale yellow).The optimal temperature rise of graphite furnace was that dried at 120℃,ashed at 500℃,atomized at 1900℃,and clear residual temperature was 2200℃.The best sample weight was 0.25 to 0.30 g.Under the condition of the method,the linear range was range from 5 ng/ml to 80 ng/ml,the linear equation was y=0.0024x-0.0009,R2=0.9988,showed a good linear correlation.The recovery of the method was 95.2~100.1%,n=3.The precision of the results showed that RSD was 3.05%,n=6.Based on the actual test results,the reasonable index of the lead in the GB 2762 bee pollen was put forward.

bee pollen;lead;determination method;limit requirement

周萍（1969-），男，高级工程师，主要从事蜂产品品质管理与检测、食品技术与新产品开发工作，E-mail:tdbjhn@126.com

胡福良（1964-），男，教授，博导，主要从事蜜蜂科学研究，E-mail:flhu@zju.edu.cn