王月华黄明珠玄红专尹旭升

（1聊城大学生命科学学院，聊城252059；2山东省蜂业与蜂产品质量检验所，泰安271000）

松属素和木犀草素抗肿瘤活性比较

王月华1黄明珠1玄红专1尹旭升2

（1聊城大学生命科学学院，聊城252059；2山东省蜂业与蜂产品质量检验所，泰安271000）

为比较松属素和木犀草素两种黄酮类化合物的抗肿瘤功效，将正常培养的肺腺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7,MDA-MB-231）及神经胶质瘤细胞（U87、U1172）经不同浓度的松属素和木犀草素（40,80,160μm）分别处理24和48 h，倒置显微镜观察细胞形态，SRB法检测细胞存活率；吖啶橙染色观察细胞核凝集和片段化；Hoechst 33258检测细胞凋亡；Western blot检测膜联蛋白A7（ANXA7）、procaspase3和LC3B的表达。结果表明，松属素和木犀草素以剂量依赖的方式抑制A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖，而对U87和U172细胞的抑制功效较弱。Western blot结果表明，在MDA-MB-231细胞中，松属素和木犀草素上调LC3-Ⅱ的水平，促进细胞凋亡。这说明松属素和木犀草素对肺腺癌和乳腺癌细胞具有抗肿瘤功效。

松属素；木犀草素；抗肿瘤；细胞凋亡

松属素又名乔松素（5,7-二羟基黄烷酮，C15H12O4），在蜂胶中大量存在，是蜂胶中的一种主要功效成分，具有多种生物学功效，近年来松属素对神经细胞的保护功效[1]受到越来越多的重视。木犀草素（3',4',5,7-四羟黄酮，C15H10O6）是一种在各种蔬菜及水果中广泛分布的天然黄酮类化合物，具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等[2-6]，临床主要用于止咳、祛痰、消炎、治疗心血管疾病[7]等。

大量研究表明，松属素和木犀草素具有多种药理学活性，如抗炎、抗菌、保护心血管、免疫调节以及抗肿瘤[8-14]等，但其抗肿瘤的活性比较及其作用机理还不完全清楚。本研究通过SRB法检测了松属素和木犀草素对不同肿瘤细胞（A549、MCF-7、MDA-MB-231、U87和U172）的影响，通过检测细胞内procaspase 3、膜联蛋白A7（ANXA7）和LC3的水平对其抗肿瘤机理进行了初步研究，以期为松属素和木犀草素抗肿瘤应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

DMEM培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰酶、磺基若丹明B（SRB）、Hoechst 33258、吖啶橙（AO）（美国Sigma公司）；细胞培养皿、96孔板（美国Falcon公司）；Tris（上海生工），一抗procaspase3,ANXA7,β-actin和辣根过氧化物酶标记的二抗（Santa Cruz Biotechnology）；LC3B（Cell Signaling Technology）。其它试剂均为分析纯。MDA-MB-231、MCF-7、A549、U87和U172细胞由本实验保存。

1.2 主要仪器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；TE2000S倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）；AR2140电子分析天平（美国奥豪斯公司）；Milli-Q Synthesis超纯水（美国密理博公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的培养

MDA-MB-231、MCF-7、A549、U87和U172细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中。孵育条件为：5%CO2、37℃、饱和湿度CO2培养箱中。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.3.2 细胞存活率的测定

将处于对数生长期的细胞按4000个/孔种植到96孔板，37℃，5%CO2孵育，待肿瘤细胞长到60%以上，除正常组外所有处理组分别经不同浓度的松属素和木犀草素（40,80,160μm）分别处理细胞24和48 h后，弃细胞培养液，用10%三氯乙酸4℃固定1 h，然后用SRB染色10min，晾干，100 mM Tris碱溶解，在492 nm处测吸光值。细胞存活率（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%

1.3.3 细胞核凝集和片段化测定

将处于对数生长期的MCF-7细胞按4×104个/孔种植到24孔板中，37℃，5%CO2孵育，待肿瘤细胞长到60%以上，加药处理24 h，弃培养液，用1×PBS冲洗细胞，加入吖啶橙染液1min，弃吖啶橙染液，用1×PBS冲洗两次，倒置相差显微镜观察、分析结果。

1.3.4 细胞凋亡检测

将处于对数生长期的MCF-7细胞按4×104个/孔种植到24孔板中，37℃，5%CO2孵育，待肿瘤细胞长到60%以上，加药处理24 h，弃培养液，用1×PBS冲洗细胞，将Hoechst 33258应用液代替细胞培养液，37℃孵育15min；弃Hoechst 33258染液，加入PBS倒置相差显微镜观察、分析结果。

1.3.5 蛋白水平的检测

将乳腺癌MCF-7细胞经80μm待处理结束后，用蛋白裂解液收集不同处理组细胞，BCA法测定蛋白浓度。每组细胞分别经12%SDS-PAGE电泳、转印、杂交、ECL显色，得到procaspase3、ANXA7、LC3、β-actin蛋白杂交带。蛋白相对量通过Quantity One软件分析。

1.4 数据统计

采用SPSS v11.5软件包统计分析。计量资料以均数±标准差（x±S）表示，采用t检验进行统计学分析。P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同浓度的松属素和木犀草素抗肿瘤活性

经不同浓度的松属素和木犀草素（40,80,160μm）分别处理细胞24和48 h后，通过SRB测定细胞存活率，结果如图1所示。

图1 不同浓度的松属素和木犀草素对不同细胞存活率的影响

由图1可知，不同浓度的松属素和木犀草素能显著抑制乳腺癌（MCF-7、MDA-MB-231）、肺癌A549细胞的增殖，且同浓度的木犀草素抑制效果更强，并呈现时间和剂量依赖性（★P＜0.05，★★P＜0.01）。松属素和木犀草素对U87和U172细胞的增殖抑制功效较弱。

2.2 松属素和木犀草素对细胞形态的影响

通过倒置相差显微镜、AO染色和Hoechst 33258染色，分别观察了松属素和木犀草素（80μm）对MCF-7细胞核和凋亡的影响，结果见图2。

图2 松属素和木犀草素对细胞核凋亡的影响

由图2可知，80μm松属素和木犀草素处理MCF-7细胞后，经AO染色可以看出，松属素和木犀草素显著促进酸性膜泡的增多；经Hoechst33258染色后可以看出，经松属素和木犀草素处理后，细胞核断裂数目明显增加，且同浓度的木犀草素较松属素效果更显著。

2.3 松属素和木犀草素对LC3B和procaspase3蛋白水平的影响

松属素和木犀草素（80μm）处理MCF-7细胞24 h后，western blotting检测了细胞内LC3和procaspase3的水平，结果如图3所示。

图3 松属素和木犀草素对LC3和procaspase3的影响

由图3可知，80μm松属素和木犀草素处理MCF-7细胞后，显著上调LC3-Ⅱ表达水平，活化caspase3表达，同时上调ANXA7的水平。（★P＜0.05，★★P＜0.01）。

3 讨论

本文首次比较了松属素和木犀草素的抗肿瘤功效。松属素和木犀草素是两种重要的黄酮类化合物，结构类似，但松属素属于黄烷酮类，只有两个羟基取代基；木犀草素属于黄酮类化合物，有4个羟基。通过对不同肿瘤细胞存活率的影响可以看出，松属素和木犀草素对肺腺癌细胞和乳腺癌细胞表现出较强的抑制功效，且同浓度的木犀草素较松属素对肿瘤细胞的抑制更强，说明由于结构的不同，松属素和木犀草素其抗肿瘤功效是不同的。此外，松属素和木犀草素对胶质瘤细胞的存活率均无显著影响，这也说明松属素和木犀草素对肿瘤细胞的毒性具有选择性。

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Different biological activities of pinocembrin and luteolin

Wang Yuehua,Huang Mingzhu,Xuan Hongzhuan,Yin Xusheng
(1 School of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China;2 Apidology and bee product quality inspection institute of Shandong Province,Tai’an 271000,China)

To study the antitumor activities of pinocembrin and luteolin,the normal cultured human lung carcinoma (A549),human breast cancer(MCF-7,MDA-MB-231)and glioma cells(U87、U1172)were treated with different concentrations of pinocembrin and luteolin(40,80,160μm)for 24 and 48 h,respectively.The cell viability was measured by SRB method.Hoechst 33258 staining and acridine orange staining were used to observe nuclear fragmentation,respectively.The levels of procaspase3,ANXA7 and LC3B were tested by western blotting.Pinocembrin and luteolin significantly inhibited proliferation of A549,MCF-7 and MDA-MB-231 cells in a time-and dose dependent manner.However,the inhibitory effects on U87 and U172 was not significantly.Pinocembrin and luteolin also induced apoptosis and autophagy by upregulating the levels of caspase 3 and LC3-Ⅱin MDA-MB-231 cells. Pinocembrin and luteolin are potential antitumor agents especially to human lung carcinoma and breast cancer cells.

pinocembrin;luteolin;antitumor;apoptosis

国家自然科学基金（31672499），山东省高等学校科技计划项目（J16LE21）、山东省农业创新体系（SDAIT-24-05）

王月华（1990-），女，硕士研究生，研究方向为细胞生物学

尹旭升，研究员，E-mail:xushengyin@163.com