杨 雪，李云亮，王禹程，黄姗芬，魏 康，马海乐

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

大米蛋白酶解产物的血管紧张素转化酶抑制活性及其分子质量分布

杨 雪，李云亮，王禹程，黄姗芬，魏 康，马海乐*

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

本文采用碱性蛋白酶酶解大米蛋白，研究了不同时间酶解产物的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，大米蛋白水解度，酶解产物中蛋白质含量及多肽分子质量分布与酶解产物ACE抑制活性的关系。结果表明：大米蛋白的水解度在15 min内呈现线性增长，60 min后逐渐趋于平缓；75 min酶解产物的ACE抑制率最高（63.27%），但与60、90 min的ACE抑制率无显著差异（P＞0.05）；酸溶蛋白和总蛋白含量随着酶解时间的延长，均呈现上升的趋势；多肽分子质量分布在200～1000 Da的比例最高。

大米蛋白；ACE抑制肽；蛋白质含量；分子质量分布

大米蛋白是工业生产淀粉或糖的副产物，氨基酸组成平衡且富含必需氨基酸。然而，其中几乎不溶于水的高含量的谷蛋白限制了大米蛋白在食品工业中的应用。因此，造成了优质蛋白资源的浪费。研究表明，植物蛋白具有多种生物学活性，尤其是蛋白经过酶解以后 （Kuba等，2009）。因此，制备活性多肽是对大米蛋白合理利用的一个有效途径。

高血压是一种慢性的心血管疾病（Chen等，2013），能引起中风、慢性肾病、心脏衰竭和许多其他的并发症，对于老年人更为严重（Bakris等，2009）。众所周知，血管紧张素转化酶（ACE）能将无活性的血管紧张素-I转化为有活性的血管紧张素-Ⅱ，同时使缓激肽失活，从而达到升高血压的目的。因此，血管紧张素转化酶抑制剂能抑制ACE的活性，从而控制血压 （Correa等，2014）。研究表明，从植物中提取的多肽具有高效的ACE抑制活性 （Ambigaipalan等，2015；Jia 等 ，2015；Qu等 ，2013；Jia等 ，2010；Vercruysse等，2009）。

碱性蛋白酶广泛地应用于蛋白酶解（Zhong等，2007；Zhu等，2006），并且具有比风味蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，中性蛋白酶，胃蛋白酶，复合蛋白酶和胰蛋白酶更高的水解能力（Ambigaipalan等，2015；Ahn等，2012）。碱性蛋白酶可切割蛋白质或肽的共价连接，并通过水解分解成小分子肽，蛋白水解的程度可以反映其水解过程。随着酶解时间的延长，酶解液中的多肽含量逐渐增多，其中二肽和三肽不仅能快速被人体吸收，并且有很高的降血压活性。因此，本文研究了大米蛋白在不同时间酶解后的ACE抑制活性，以及酶解产物中酸溶蛋白的含量和分子质量分布的关系。

1 材料与设备

1.1 材料 大米蛋白 （蛋白质含量57.90%），由湖北京源山生物技术有限公司提供。血管紧张素转化酶（ACE），实验室自制。马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hippuryl-His-Leu，HHL），购于Sigma公司。碱性蛋白酶，酶活2.280×105U/g，购于诺维信生物技术有限公司。其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器 WFJ 7200型可见分光光度计，北京普析仪器有限公司；PHS-3C精密pH计，上海精密科学仪器有限公司；LD5-2A离心机，北京医用厂；Agilent 1100液相色谱，美国安捷伦公司。

2 试验方法

2.1 大米蛋白酶解液的制备 称取12 g大米蛋白放入烧杯中，加入400 mL蒸馏水，待温度升高到50℃时，用1 mol/L NaOH调节pH至8.5，稳定10 min后，加入0.9 mL碱性蛋白酶开始酶解，在酶解过程中滴加NaOH维持pH稳定。分别在酶解30、45、60、75、90 min时取样，沸水浴灭酶10 min，冷却后于5000 r/min离心15 min，收集上清液待测。

2.2 大米蛋白水解度的测定 水解度的测定采用pH-Stat法Adler-Nissen（1989），计算公式如下：

式中：B为消耗氢氧化钠的体积，mL；Nb为氢氧化钠的浓度，mol/L；α在本试验条件下为0.9617；htot为每克蛋白质的肽键，mmol/g，大米蛋白为8.40。

2.3 ACE抑制活性的测定 ACE抑制率的测定采用高效液相色谱法检测（Jia等，2010）。计算公式为：

式中：Sb为空白试剂马尿酸的峰面积，Si是待测样品马尿酸的峰面积。

2.4 酶解产物中总蛋白和TCA酸溶蛋白的测定总蛋白的测定采用福林酚法测定。测定TCA酸溶蛋白的样品处理方法如下：20 mL酶解液加入10 mL 15%三氯乙酸，于25℃水浴条件下沉淀大分子蛋白30 min后，5000 r/min离心15 min，收集上清液测定酸溶蛋白含量。

2.5 酶解液中多肽的分子质量分布 酶解液中多肽的分子质量分布采用高效液相排阻色谱法，色谱柱：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流速0.5 mL/min，进样量30 μL，柱温30℃。校准曲线根据平均洗脱体积和相应标准物质的分子质量绘制。标准物质分别为：牛血清白蛋白（66430 Da），细胞色素C（12500 Da），杆菌肽（1450 Da），色氨酸（204.23 Da）。

2.6 数据分析 试验结果采用SPSS软件对显著性进行方差分析，试验结果均以 “平均值±标准差”表示。所有图表均由OriginPro8软件绘制。

3 结果与讨论

3.1 酶解产物ACE抑制活性 多肽具有多种生物学活性，尤其是ACE抑制活性（Bernardini等，2012）。不同酶解时间酶解产物的ACE抑制率结果见图1，酶解30、45、60、75、90 min的ACE抑制率分别为 （60.34±0.42）%，（65.85±1.21）%，（71.58±1.10）%，（73.27±0.36）%和 （69.67± 0.41）%。后三者的ACE抑制活性没有显著差异（P＞0.05）。这与绵羊干酪乳清蛋白的结果不同（Correa等，2014）。其原因可能是，不同的原料其氨基酸组成不同，不同的酶解时间产生多肽的种类也不相同，酶解75 min的ACE抑制活性有降低的趋势，原因可能是因为酶解时间过长，导致多肽过度酶解，形成大量氨基酸所致。

图1 大米蛋白酶解产物的ACE抑制率

3.2 大米蛋白的水解度 不同时间大米蛋白的水解度结果见图2，在酶解的前15 min，酶解曲线几乎呈现线性增长，大米蛋白的水解度在酶解30～90 min内，从17.71%增加到23.23%，在酶解60 min以后趋于平缓。此结果与酶解产物ACE抑制率的结果相符。

图2 大米蛋白水解度

3.3 酶解产物中总蛋白含量和TCA酸溶蛋白含量 酶解产物中总蛋白和TCA酸溶蛋白含量结果见图3，酶解可以提高蛋白质含量和酸溶蛋白含量。TCA酸溶蛋白占总蛋白的比例分别为56.80%、57.95%、70.19%、82.00%和83.28%，由试验结果可知，随着酶解时间的增加，大分子蛋白含量逐渐降低。

图3 酶解产物中总蛋白和TCA酸溶蛋白含量

水解产物的总蛋白质含量，是评价其生物活性的一个重要指标。TCA是一种蛋白质凝结剂，可以通过暴露蛋白的疏水性基团而沉淀大分子蛋白，但小分子的多肽则不会析出 （Jang等，2016；Sokolowski等，2003）。随着酶解过程的进行，大分子蛋白之间的肽键逐渐断裂。

3.4 酶解产物中多肽的分子质量分布 标准物质和酶解液多肽的分子质量色谱分别如图4（1）和（2）所示，酶解产物的多肽分子质量分布的结果见表1。酶解30 min的酶解产物中，多肽分子质量大于1000 Da的比例最高（30.13%），并且与其他时间的酶解产物的多肽相比具有显著差异（P＜0.05）。酶解60 min的酶解产物中，多肽分子质量介于200～1000 Da的比例最高，且与酶解75 min和90 min的多肽分子质量分布没有显著差异（P＜0.05）。同时，酶解30 min的多肽小于200 Da的比例最低（27.35%），随后呈现逐渐增加的趋势。随着水解的进行，小分子肽或氨基酸的含量增加。

图4 大米蛋白酶解产物多肽分子质量分布

表1 酶解产物中多肽的分子质量分布

大多数氨基酸的分子质量小于200 Da，而多数的生物活性肽的分子质量为200～1000 Da（Jin等，2016b）。分子质量分布的结果与ACE抑制活性的结果相一致，说明ACE抑制率的大小可能与200～1000 Da多肽分子质量的分布有关。

4 结论

本研究结果表明：（1）不同酶解时间产物ACE抑制活性不同，随着酶解的进行，ACE抑制率先升高，然后趋于稳定；（2）大米蛋白水解度在前15 min呈现线性增加，60 min后逐渐平缓，与ACE抑制率的变化趋势相同；（3）总蛋白质和TCA酸溶蛋白含量随时间增加均显著增加，并且TCA酸溶蛋白占总蛋白的含量不断升高，相对应时间的ACE抑制率也显著提高；（4）随着酶解的进行，酶解产物中分子质量分布在200～1000 Da多肽含量不断升高，然后趋于平稳，此结果与ACE抑制活性一致，说明ACE抑制活性与200～1000 Da多肽的分布呈正相关。

综上所述，酶解产物ACE抑制活性与蛋白质水解度、总蛋白质和酸溶蛋白质含量、多肽分子质量分布均有一定的相关性。

The angiotensin-I-converting enzyme（ACE）inhibitory activity of hydrolysates from rice protein hydrolyzated by alcalase at different time was studied.And the degree of hydrolysis（DH），protein content，the relationship between molecular weight distribution of hydrolysates and ACE inhibitory activity were also discussed.The results showed that the DH of rice protein presented linear growth within 15 min and flatten gradually after 60 min.ACE inhibitory rate of hydrolysates for 75 min was the highest（63.27%）and had no significant difference compared to that of 60 min and 90 min （P>0.05）.TCA-soluble protein and total protein content showed an upward trend during enzymatic process.Molecular weight distribution presented the highest proportion between 200 and 1000 Da.

rice protein；ACE inhibitory peptide；protein content；molecular weight distribution

S816.11

A

1004-3314（2017）03-0023-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170307

基金课题：国家863计划“高生物利用度蛋白制备关键技术研究与开发”（2013AA102203）；江苏大学高级人才科研启动基金（16JDG049）

*通讯作者