段雨函，吴钢

· 论著 ·

内皮单核细胞活化多肽Ⅱ及趋化因子受体3在高糖介导血管内皮细胞损伤中的表达变化及机制研究

段雨函1，吴钢1

目的研究内皮单核细胞活化多肽Ⅱ（EMAPⅡ）及其受体CXC型趋化因子受体3（CXCR3）在高糖介导的血管内皮细胞损伤中的表达变化及潜在机制。方法以不同浓度高糖处理血管内皮细胞72 h，建立拟糖尿病视网膜病变（DR）血管内皮细胞慢性损伤模型，其中分为4组：1组正常糖浓度组（对照组），其他3组由不同浓度的高糖组成。应用细胞活性检测试剂盒（CCK-8）检测不同糖浓度对细胞活性的影响；应用检测试剂盒测定细胞损伤相关指标；应用qPCR和Western blot方法分别检测EMAPⅡ及其受体CXCR3 mRNA和蛋白表达变化。结果与对照组相比，CCK-8法细胞活性检测结果显示，各葡萄糖浓度处理组细胞吸光度，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，3组高糖处理组细胞活性均显著下降，且随糖浓度升高细胞活性逐渐降低。炎性因子和过氧化物检测结果显示，高糖环境可诱导细胞大量释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）等炎性介质，结果有统计学意义（P＜0.05）；Western blot和qPCR结果显示，高糖环境可使细胞的EMAPⅡ及其受体CXCR3表达显著上调，结果有统计学意义（P＜0.05）。结论高糖处理可使血管内皮细胞的EMAPⅡ及其受体CXCR3表达上调，进而介导TNF-α、NO和ROS等炎性介质的释放，最终造成细胞损伤。

EMAPⅡ；CXCR3；血管内皮细胞；糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病变（DR） 是糖尿病微血管病变中的典型代表，糖尿病常见慢性并发症[1]。研究发现，DR由视网膜微血管长期处于高血糖环境引发，多种炎性因子、过氧化物及类花生酸类物质与其病理生理过程有关[2]。促血管生长因子及其抑制因子失衡可引起视网膜血管内皮功能紊乱，或抑制新生血管形成[3]。CXC型趋化因子受体3（CXCR3）可在血管内皮细胞表达，是位于细胞表面的七亚基穿膜受体，属G蛋白偶联受体家族[4]。研究显示，CXCR3与配体结合后可调节多种类型的炎症细胞趋化和激活，在介导炎性介质释放、内皮细胞迁移、介导血管增生及纤维化和微血管重塑等方面具有重要作用[5-7]。内皮单核细胞活化多肽Ⅱ（EMAPⅡ）可介导内皮细胞、单核细胞和中性粒细胞生理功能的改变，进而引起细胞凋亡和抑制新生血管形成。EMAPⅡ也可与CXCR3结合，介导细胞趋化、激活和下游一系列生理病理过程[8,9]。本研究主要通过高糖处理血管内皮细胞，建立拟DR血管内皮细胞损伤模型，在细胞水平上探究EMAPⅡ及其受体CXCR3在拟DR血管内皮细胞损伤中的表达变化，对研究DR可能性发病机制和探索其潜在治疗手段等方面具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象与实验分组人血管内皮细胞系由中国典型培养物保藏中心提供。所用细胞培养液为无糖型RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液）。细胞冻存管从液氮中取出后迅速投入37℃恒温水浴中快速解冻，离心后重悬细胞，传2～3代达到经稳定状态后用于实验，所用细胞均控制在35代以内。以无糖型RPMI-1640培养基为基础加入葡萄糖，分别配制4组不同浓度梯度的葡萄糖浓度[10]，即：5.5 mM/L（对照组）、11.1 mM/L、22.2 mM/L和44.4 mM/ L。各组葡萄糖浓度培养基中均加入相应剂量的甘露聚糖以排除渗透压对细胞活性的影响。

1.2 材料与试剂无糖型RPMI-1640培养基（SN30809.018）由HyClone公司提供；葡萄糖和胎牛血清（1438121）均由gibco公司提供；CCK-8细胞活性检测试剂盒（FP101-01）由北京全式金生物技术有限公司提供；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（EK0526）由武汉博士德生物工程有限公司提供；一氧化氮（NO）（S0021）和活性氧（ROS）检测试剂盒（S0033）均由碧云天生物技术有限公司提供；qPCR上下游引物由上海生物工程有限公司合成；山羊抗兔内皮单核细胞活化多肽Ⅱ（EMAPⅡ，ab188320）及CXC型趋化因子受体3（CXCR3，ab154845）多克隆抗体由Abcam公司提供；GAPDH单克隆抗体（TA336621）由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；总RNA提取试剂盒（AM1924）及逆转录试剂盒（4387406）由Thermo公司提供；qPCR试剂盒（638320）由TakaRa公司提供。

1.3 CCK-8法检测细胞活性在96孔板中接种细胞，接种密度约为1×105/ml，每孔100μL。待细胞贴壁后，按实验所设分组全量更换含有不同糖浓度的培养基，每24 h换液一次，共处理72 h。CCK-8储存液按1:10的比例用基础培养基稀释，高糖处理72 h后更换CCK-8稀释液，每孔100μL，于37℃培养箱（5%CO2）孵育2 h，使用酶标仪（美国PerkinElmer公司）在450 nm波长下检测每孔的吸光度，以吸光度大小表示各组细胞活性。

1.4 TNF-α、NO和ROS含量检测本研究为探讨TNF-α和NO及ROS等过氧化物是否与高糖介导的细胞损伤相关，采用ELISA双抗夹心法检测各组细胞上清液中的TNF-α含量，高糖处理72 h后吸取细胞上清液离心（1000 rpm，30 s）取上清备用。按试剂盒说明书设置标准品浓度梯度，实验重复3次，结果使用多功能酶标仪在450 nm波长读取。每次实验均绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中TNF-α含量；采用硝酸还原酶法NO检测试剂盒测定细胞上清液中NO含量，所有实验操作均按照说明书进行。每组设置 3个平行复孔，实验重复3次，结果采用多功能酶标仪在550 nm波长读取吸光度，再根据说明书所给的公式计算得出；采用ROS检测试剂盒测定细胞内活性氧水平，按预先设计分组对细胞进行不同处理，每组设置 3个平行复孔。按照1:1000的比例用无血清1640培养基稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM/L。高糖处理72 h后更换DCFHDA稀释液，于37℃细胞培养箱内孵育30 min。用D-Hanks液洗涤细胞3次后使用多功能酶标仪以488 nm为激发波长，525 nm为发射波长，实时检测各组荧光强弱。

表1 受检者的一般资料及生化指标比较（s）

表1 受检者的一般资料及生化指标比较（s）

注：BMI：体质指数；TC：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；FPG：空腹血糖；与冠状动脉正常组相比，aP＜0.05；与A组相比，bP＜0.05；与B组相比，cP＜0.05；与C组相比，dP＜0.05

指标 冠脉正常组（n=38） A组（n=31） B组（n=33） C组（n=32） D组（n=30）男性（n，%） 21（55.3） 18（58.1） 17（51.5） 18（56.3） 19（63.3）年龄（岁） 58.89±5.57 61.84±6.54a61.88±5.33ab69.69±5.95abc68.27±4.57abcdBMI（kg/m2） 22.54±2.25 23.61±2.41a23.39±2.86ab24.49±2.08abc23.1±1.78abcdTC（μmol/L） 5.35±0.60 5.51±0.59 5.67±0.51 5.6±0.59 5.66±0.56 TG（μmol/L） 1.11±0.15 1.74±0.13a1.92±0.14ab1.86±0.12abc2.05±0.15abcdHDL-C（μmol/L） 1.29±0.23 1.21±0.23 1.22±0.23 1.18±0.23 1.12±0.23 LDL-C（μmol/L） 2.68±0.14 2.97±0.19a3.27±0.17ab3.78±0.20abc3.88±0.16abcdFPG（μmol/L） 5.73±0.52 5.71±0.54 5.86±0.58 5.88±0.58 5.98±0.57收缩压（mmHg） 122.42±6.53 124.52±6.72a126.48±6.97ab130.53±6.77abc140.07±6.61abcd舒张压（mmHg） 71.16±4.62 77.65±4.55a77.06±5.53ab80.22±5.16abc81.57±3.96abcd

1.5 实时荧光定量PCR法检测细胞EMAPⅡ及CXCR3 mRNA表达按照RNA提取试剂盒所列步骤分别提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒经37℃恒温水浴（上海齐欣，CU-600）1 h反转录成cDNA。应用SYBR® Green（TakaRa公司，638320）荧光染料法，所用PCR退火温度为60℃。EMAPⅡ上下游引物分别为：5’-CCACC AATTTTGGCACCGTG-3’ 和 5’-ACGCTCGCAC TGTGAGTATC-3’，产物长度为161bp；CXCR3上下游引物分别为：5’-GGAGCAATTATGGCAC GATG-3’ 和 5’-TCGCACCCTCTGTGACTAAC-3’，产物长度为175bp；内参GAPDH上下游引物分别为：5’-TCGTTCCACGCCTAGTAGCGCAA-3’和 5’-AGTTGTGATCAAGAACGTGCTGAAT-3，产物为194bp。各组细胞mRNA相对表达量计算方法为2-ΔΔCT法，将对照组标准化为1，以相对值（Relative quality，RQ）表示EMAPⅡ及CXCR3 mRNA的相对表达量。

1.6 Western blot法检测细胞EMAPⅡ及CXCR3蛋白表达按实验所设分组用6孔板接种细胞，高糖处理72 h后，经RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后分别孵育一抗，4℃孵育过夜。EMAPⅡ和CXCR3羊抗兔多克隆抗体稀释比例为1:1000；GAPDH单克隆抗体稀释比例为1:500。次日，经洗膜后分别孵育二抗，比例为1:2000，常温孵育1 h，再经洗膜后通过凝胶成像仪曝光显影，结果经Image-Pro Plus 5.0分析软件采集。其中EMAPⅡ蛋白质量为43kD，CXCR3蛋白质量为41kD。

1.7 统计学分析实验中所有数据采用SPSS 19.0分析软件进行处理，所有数据用（s）表示。多组间整体比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 高糖可介导血管内皮细胞损伤CCK-8法细胞活性检测结果显示，各葡萄糖浓度处理组细胞吸光度，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步分析显示，与对照组相比，11.1 mM/L葡萄糖浓度对细胞活性可产生影响（P＜0.05），而22.2 mM/L和44.4 mM/L葡萄糖浓度均可明显影响细胞活性（P＜0.01），其中44.4 mM/L葡萄糖浓度细胞大量死亡（表1）。

2.2 高糖诱导细胞TNF-α、NO和ROS释放量增加各处理组细胞上清液中TNF-α、NO含量及细胞内ROS水平，组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。组间比较显示，与对照组相比，11.1 mM/L葡萄糖浓度组细胞的TNF-α、NO含量及细胞内ROS水平均无显著变化（P＞0.05），而22.2 mM/L和44.4 mM/L葡萄糖浓度组细胞变化较为明显（P＜0.01），且随葡萄糖浓度增加呈上升趋势（表2）。

表1 CCK-8法检测各组细胞的吸光度（s）

表1 CCK-8法检测各组细胞的吸光度（s）

注：与对照组相比，aP＜0.05，bP＜0.01

对照组 5 1.09±0.14 11.1 mM/L组 5 0.97±0.11a22.2 mM/L组 5 0.84±0.12b44.4 mM/L组 5 0.50±0.09b

2.3 高糖诱导细胞EMAPⅡ及CXCR3 mRNA表达上调结果显示各葡萄糖浓度处理组细胞EMAPⅡ mRNA相对表达量分别为：1，1.16± 0.11，1.68±0.13和2.13±0.12，组间比较有统计学差异（F3,16=33.654，P＜0.001）；CXCR3 mRNA相对表达量分别为：1，1.22±0.11，1.75 ±0.18和1.91±0.16，组间比较有统计学差异（F3,16=26.361，P＜0.001）。组间两两比较结果显示，与对照组相比，各葡萄糖浓度均可使血管内皮细胞EMAPⅡ及CXCR3 mRNA表达上调（P＜0.05），且22.2 mM/L和44.4 mM/L葡萄糖浓度组上调效果最为明显（图1）。

2.4 高糖诱导细胞EMAPⅡ及CXCR3蛋白表达上调Western blot检测结果显示，各葡萄糖浓度处理组细胞EMAPⅡ蛋白相对表达量分别为：0.31 ±0.04，0.41±0.05，0.81±0.07和0.85±0.09，组间比较差异有统计学意义（F5,16=25.226，P＜0.001）；各组细胞CXCR3受体蛋白相对表达量分别为：0.29±0.03，0.35±0.04，0.85 ±0.07和088±0.09，组间差异有统计学意义（F5,16=47.318，P＜0.001）。进一步分析显示，与对照组相比，各组葡萄糖浓度均能诱导血管内皮细胞EMAPⅡ及CXCR3蛋白表达上调（P＜0.05）（图2）。

3 讨论

近年来，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病患病率也呈上升趋势，已成为威胁人类健康的又一大杀手[11]。糖尿病患者往往伴随诸如糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病心脑血管病，糖尿病神经病变等在内的多种并发症，其中DR是糖尿病眼病中的典型代表，其主要是因眼局部微血管长期处于高血糖环境产生病变引起的一种慢性炎症性疾病[11-14]。研究发现，机体长期处于高血糖状态，可对局部组织和细胞产生毒害作用，其生理病理机制与多种炎性因子、过氧化物及类花生酸类物质有关[15]。人体正常空腹血糖范围约为3.9～6.1 mM/L之间，餐后血糖约为11.1 mM/L左右。通过设置不同葡萄糖浓度处理血管内皮细胞，以此来模拟空腹、餐后及糖尿病高血糖状态下细胞生存环境，并通过CCK-8法检测细胞活性指标来度量不同葡萄糖浓度对细胞的损伤程度。结果显示，各组细胞活性随葡萄糖浓度升高而逐渐降低，表明高糖环境可对血管内皮细胞存活产生影响。

表2 各处理组细胞TNF-α、NO及ROS检测结果（s）

表2 各处理组细胞TNF-α、NO及ROS检测结果（s）

注：TNF-α：肿瘤坏死因子α；NO：一氧化氮；ROS：活性氧；与对照组相比，aP＜0.05，bP＜0.01

对照组 3 69.24±9.61 18.51±3.35 246.45 11.1 mM/L组 3 89.15±9.89a25.19±4.98a295.55a22.2 mM/L组 3 123.17±12.79b38.05±4.11b446.67b44.4 mM/L组 3 219.58±15.89b54.80±5.36b754.31b

图1 各葡萄糖浓度处理组细胞EMAPII及CXCR3 mRNA表达情况[与对照组相比，aP＜0.05，bP＜0.01（n=5）]

图2 各葡萄糖浓度处理组细胞EMAPⅡ及CXCR3蛋白表达情况[A：EMAPⅡ SDS-PAGE电泳典型条带；B：各组EMAPⅡ蛋白表达情况；C：CXCR3 SDS-PAGE电泳典型条带；D：各组CXCR3蛋白表达情况注：与对照组相比，aP＜0.05，bP＜0.01（n=5）]

CXCR3是一种七亚基跨膜受体，属于G蛋白偶联家族[4]。其主要在T细胞、NK细胞、内皮细胞及部分上皮细胞中表达，在组织细胞功能趋化、细胞免疫、抑制微血管形成及损伤修复等多方面具有重要作用[16,17]。研究发现，EMAPⅡ具有促进细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成的特性；其也可与CXCR3结合，进而通过p38MAPK通路介导炎性因子和过氧化物生存，进而对周围细胞产生损害作用[18-20]。我们通过qPCR及Western blot法分别检测了各葡萄糖浓度组细胞的EMAPⅡ及CXCR3 mRNA和蛋白表达变化，结果显示，与对照组相比，各葡萄糖浓度组细胞的EMAPⅡ及CXCR3 mRNA和蛋白表达均明显增加，表明高糖环境可诱导细胞大量表达EMAPⅡ因子及其受体CXCR3。结合CCK-8检测结果，可发现各组细胞活性与qPCR及Western blot结果呈负相关，表明EMAPⅡ及其受体CXCR3可能参与高糖介导血管内皮细胞损伤。

炎性因子与过氧化物检测结果也显示，高糖能诱导细胞大量释放TNF-α、NO和ROS等炎性介质，可对自身和周围细胞造成毒害作用，这与mRNA和蛋白检测结果相一致。由此推测，TNF-α、NO和ROS等炎性介质的生成可能与EMAPⅡ及CXCR3的表达上调有关。

总之，本研究通过实验发现，高糖可诱导血管内皮细胞EMAPⅡ及CXCR3表达上调，进而通过介导炎性因子和过氧化物生成对细胞产生毒害作用，但详细机制还有待进一步探究。本实验在细胞水平上模拟机体内组织细胞高糖环境，研究EMAPⅡ及CXCR3的表达变化，这对进一步研究高糖对细胞损伤作用的机制及探索DR等糖尿病并发症潜在的治疗手段等方面具有重要意义。

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本文编辑：戴楠，田国祥

Expression changes and effective mechanism of endothelial monocyte-activating polypeptide Ⅱ and C-X-C chemokine receptor type 3 in hyperglycemia-mediated vascular endothelial cell injury

DUAN Yu-han*, WU Gang.*Clinical Laboratory Center, Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture, Enshi 445000, China.

WU Gang, E-mail: 1044156103@qq.com

Objective To study the expression changes and potential mechanism of endothelial monocyteactivating polypeptide Ⅱ (EMAPⅡ) and C-X-C chemokine receptor type 3 (CXCR3) in hyperglycemia-mediated vascular endothelial cell injury.MethodsThe vascular endothelial cells were treated with high-level glucose in different doses for 72 h for establishing the model of vascular endothelial cell injury of imitated diabetic retinopathy (DR), and divided into control group and other 3 hyperglycemia groups. The influence of different-dose glucose on cytoactive was detected by using cell counting kit-8 (CCK-8), relevant indexes of cell injury were detected by using detection kit, and expression changes of EMAPⅡ and CXCR3 mRNA were detected respectively by using quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Western blot method.ResultsThe results of CCK-8 detection showed that cell absorbance had statistical difference in 3 hyperglycemia groups compared with control group (P＜0.05). The cytoactive decreased significantly in 3 hyperglycemia groups compared with control group, and decreased gradually as the increase of glucose level. The detection results of inflammatory factors and peroxides showed that high-glucose environment induced the release of a large number of inflammatory mediators such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) by vascular endothelial cells (P＜0.05). The results of Western blot and qPCR showed that the expressions of EMAPⅡ and CXCR3 were significantly up-regulated by high-glucose environment (P＜0.05).ConclusionThe high-glucose treatment can up-regulate the expressions of EMAPⅡ and CXCR3 in vascular endothelial cells, and further induce the release of inflammatory mediators including TNF-α, NO and ROS and cause cell injury.

Endothelial monocyte-activating polypeptide II; C-X-C chemokine receptor type 3; Vascular endothelial cells; Diabetic retinopathy

R587.1

A

1674-4055(2017)01-0088-04

1445000 恩施,恩施土家族苗族自治州中心医院临床检验中心

吴钢,E-mail:1044156103@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.01.24