张娴，谢连红，朱旭婷，林琳，曲毅

· 论著 ·

microRNA195在心力衰竭的表达及其对心肌细胞增殖的影响

张娴1，谢连红1，朱旭婷1，林琳1，曲毅1

目的探讨microRNA-195（miR-195）在心力衰竭（心衰）患者的表达及其对心肌细胞H9C2增殖的影响。方法选取2015年3月～2015年7月于上海市第一人民医院56例心衰患者和40例正常人群血清标本为研究对象，利用Taqman探针实时定量PCR方法检测miR-195的表达，用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将miR-195类似物（mimic）转染到H9C2心肌细胞中，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和EdU实验检测细胞增殖情况，Western blot检测其下游CDCA4 蛋白的表达情况。比较心衰患者和正常人群血清及转染心肌细胞中miR-195表达、分析miR-195对心肌细胞增殖及CDCA4 蛋白表达的影响。结果与正常人群相比，心衰患者血清中miR-195表达量明显升高（P＜0.05），MTT结果显示在转染48、72、96 h后，转染miR-195 mimic组细胞吸光值明显低于阴性对照组（P＜0.05）。EdU结果显示miR-195转染组细胞增殖受到明显抑制（P＜0.05）。Western blot结果显示miR-195抑制心肌细胞中CDCA4 蛋白表达。结论miR-195在心衰患者血清中表达水平升高，并且可能通过影响CDCA4的表达抑制H9C2细胞的增殖。

miR-195；心力衰竭；增殖；心肌细胞

心力衰竭（心衰）是一种复杂的病理生理状态，以心脏的收缩功能和（或）舒张功能障碍为主要特点[1]。心衰的病因主要为心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等原因引起的心肌损伤，造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血或充盈功能低下。心衰的患病率和致死率高，严重影响生活质量，有研究显示，目前心衰影响人群约占世界总人口的0.4%～2%，是人类健康第一大杀手[2]。

microRNA是一类长约20～25nt的高度保守的内源性单链小分子非编码RNA，通过与相关蛋白形成RNA诱发沉默复合体来介导转录后基因表达的调控，决定细胞分化、胚胎发育等一系列重要生命活动的进程及多样性，是一种重要的基因转录后调控机制[3]。现研究表明，microRNA参与人体多种信号过程，包括增殖、分化及凋亡等[4]。目前，很多研究发现miRNA的异常表达与心脏发育相关，除此之外，与心衰也存在直接或间接的相关性。

通过前期qRT-PCR方法，对心衰患者和正常对照人群血清的6个候选miRNA的表达进行了检测，发现miR-195在心衰患者血清中表达水平显著提高，但其与心衰的关系目前尚未明了，本研究旨在探索miR-195在心衰中的作用，为心衰的发生发展及治疗提供一个新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养心肌细胞H9C2购于上海细胞研究所，用含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.1.2 临床病例标本收集2015年3月～2015年7月于上海市第一人民医院老年科收集了56例心衰患者和40例正常对照人群血清标本, 于-80℃保存。其中心衰患者中男性31例，女性25例，平均年龄（65.21±11.59）岁，其诊断符合Farmingham[5]诊断标准。主要标准：阵发性夜间呼吸困难；颈静脉怒张；肺啰音；心脏扩大；急性肺水肿；第三心音奔马律；静脉压增高（＞16 cmH20）。次要标准：踝部水肿；夜间咳嗽；活动后呼吸困难；肝肿大；胸腔积液，肺活量降低至最大肺活量的1/3；心动过速（＞120 次/min）。主要或次要标准包括：治疗5 d以上时间后体质量减轻≥4.5 kg。符合二项主要标准，或符合一项主要标准及二项次要标准者可确立诊断。排除肾病综合征、肺心病、先心病、风湿性心脏瓣膜病、扩张型及肥厚型心肌病等。正常对照人群中男性20例，女性20例，平均年龄（65.14±10.15）岁，且均无心脏疾病史及遗传病史。

1.1.3 主要试剂Trizol LS Reagent（美国invitrogen公司）；TaqmanmiRNA逆转录试剂盒（美国 ABI公司）；TaqMan实时定量PCR Master Mix（美国ABI公司）；实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）仪（美国ABI公司）；DMEM高糖培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；脂质体 LipfectamineTM2000（美国invitrogen公司）；miR-195 mimic（上海吉玛生物科技有限公司）；EdU细胞增殖检测试剂盒（广州市锐博生物科技有限公司），CDCA4抗体（美国 Santa Cruz 公司）。

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR利用Trizol LS Reagent提取血清中总RNA，然后用TaqmanmiRNA逆转录试剂盒将200 ng RNA逆转录成cDNA，Taqman探针法实时定量PCR，检测血清中miR-195及U6的含量。逆转录反应体系为10 μL：Nucleasefree water 6.1 μL、10×Reverse Transcription Buffer 1.0 μL、100 mmol/L dNTPs 0.1μL、RNase inhibitor（20 U/μL）0.13 μL、MultiScribeTM Reverse Transcriptase（50 U/μL）0.67μL、TaqManMiRNA Assay（5x）1μL、RNA（2 00ng/ μL）1 μL，反应条件：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min。实时定量PCR反应体系为10 μL：TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 5 μL、Nuclease-free water 2.5μL、TaqManMiRNA Assay（20×）0.5 μL、RT reaction product（稀释10倍后） 2μL、反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。miR-195的相对表达量以2－△△CT法计算。

1.2.2 细胞转染参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书，转染前将对数生长期的H9C2细胞按2×105个/孔接种于6孔板上培养，待细胞融合70%～80%时，用Lipofectamine 2000试剂将miR-195 mimic及阴性对照（无关序列）转染至H9C2细胞。具体步骤：将5μL脂质体加到250μLDMEM无血清培养基中，静置5 min，另取5μL miR-195 mimic（20 pmol）加入到250μLDMEM无血清培养基中，将两个溶液混合并轻轻摇匀，室温放置30 min，弃去培养基，用1×PBS清洗后加入Lipofectamine/miR-195 mimic混合溶液，培养6 h后更换完全培养基继续培养24 h后做后续实验。转染阴性对照组操作同上。

1.2.3 MTT检测细胞增殖实验将转染24 h的H9C2细胞以每孔3×103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl，同时设置空白对照孔（只加培养基），分别培养转染48、72、96 h后每孔加入MTT（5 mg/ml）20μl，至终浓度为1 mg/mL，置于37℃培养箱培养4～6 h，弃去培养基，每孔加入DMSO 150μl，37℃震荡10 min，使结晶产物充分溶解，以空白孔调零，酶标仪上562 nm测定各孔吸光度值（OD值），以相对应的OD比值表示细胞增殖能力的大小。每组取5孔平均值绘制增殖曲线，重复实验三次。

1.2.4 Edu检测细胞增殖将对数生长期的H9C2细胞以3×103个/孔接种于96孔板，于转染48 h后每孔加入50 μmol/L EdU试剂100 μl，37摄氏度孵育2 h，弃去培养基，每孔加50 μl 4%多聚甲醛，室温固定30 min；弃去固定液，每孔加50μl 2 mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5 min；弃去甘氨酸溶液，1×PBS清洗5 min；弃去PBS，每孔加入 100 μl 0.5% TritonX-100的PBS，孵育10 min，PBS 冲洗 1 次；每孔加入 100 μl 1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30 min后，弃染色反应液；PBS冲洗 1次；甲醇洗1～2次后PBS洗1次；每孔加入 10 μl 1×DAPI反应液，避光、室温孵育10 min；在荧光显微镜下进行观察及图片采集。随机选取5个视野，分别计数视野下红色荧光细胞数（EdU阳性细胞数）和蓝色荧光细胞数细胞核总数（DAPI阳性细胞数）按下列公式计算细胞增殖率（%）=EdU阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。

1.2.5 Western Blot检测转染48 h后提取细胞全蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取70 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，结束后转印至NC膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，X胶片曝光显影。

1.2.6 统计学处理采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（s）表示，两组间均数的比较采用t检验，计数资料采用构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-195在心力衰竭患者血清中高表达提取血清样本中的总RNA，反转成cDNA之后利用实时定量PCR对56例心衰患者和40例正常对照人群血清进行了miR-195含量的检测，结果显示（图1）：心衰患者血清中miR-195含量显著高于正常人群，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 转染心肌细胞中miR-195的表达H9C2细胞转染miR-195 48 h后提取细胞总RNA，利用探针实时定量PCR方法检测miR-195的表达，发现转染后miR-195表达量显著增加（P＜0.001）（图2）。实验结果说明可以通过转染miR-195 mimic来增加H9C2细胞中miR-195的表达量，后续实验可以通过这种方法提高miR-195表达量。

2.3 miR-195抑制心肌细胞增殖MTT结果显示（图3），转染后48 h、72 h和96 h组，miR-195转染组细胞生长与阴性对照组相比受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.05）；EdU结果显示（图4），与阴性对照组相比，转染miR-195 48 h的细胞数量相对较少，增殖明显受到抑制。表1显示，通过比较两组EdU阳性率，发现miR-195能明显抑制细胞增殖，差异显著（P＜0.01）。

2.4 miR-195抑制心肌细胞中CDCA4蛋白表达H9C2细胞转染miR-195 mimic 72 h 后，提取蛋白进行Western blot , 发现miR-195转染组CDCA4蛋白水平明显低于阴性对照组，差异有统计学意义（图5）。表明miR-195可能是通过影响CDCA4蛋白的表达进而抑制细胞增殖。

3 讨论

心衰的发生及发展是一系列复杂的过程，心衰患者在无有效临床干预的情况下，不足的血液射流会导致补偿性激素释放、血管收缩和水肿等症状。心衰是几乎所有心血管疾病的终末表现，也是各种心血管疾病导致死亡的最主要的原因。

图1 各种血清中miR-195的表达（与正常对照相比，aP＜0.05）

图2 各组H9C2细胞中miR-195的表达（与阴性对照组相比，bP＜0.001）

图3 MTT法检测各组细胞增殖情况（与阴性对照组相比，aP＜0.05）

图4 4EdU法检测各组细胞增殖情况（×200）

有研究显示，多种miRNA在心脏发育过程中起着重要的作用，而miRNA的表达异常可导致心脏发育异常甚至会导致胚胎死亡。如miR-1可直接靶向HAND2，调控心肌细胞形态与心脏发育[6]。而miR-133a和-133b则直接靶向Cyclin D2和SRF，调控细胞周期，为心脏发育所必须。MiR-133a敲除会导致小鼠死亡，而部分敲除则会导致扩张性心肌病及心脏衰竭[7]。除了参与到心脏的正常发育相关外，miRNA的差异表达与心衰也存在直接的相关性。Matsumoto等[8]对急性心肌梗塞导致的心衰患者的血清中的miRNA表达谱进行了检测，发现miR-34a，miR-194和miR-192的表达量显著上调。Sygitowicz等[9]利用定量RT-PCR方法检测了心衰患者血清中候选miRNA的表达量，发现miR-1下调而miR-21表达显著上调。这些miRNA为早期诊断心衰提供了基础。我们对目前发表的miRNA与心衰相关文献进行了总结，从现有报道中选出6个候选miRNA分子：miR-125a ，miR-138，miR-195，miR-23a， miR-27a ，miR-499c，并对其表达量在56例心衰患者和40例健康对照人群血清中进行了检测。结果显示miR-195在心衰患者血清中表达量显著上调。

表1 EdU法检测miR-195转染后细胞增殖能力（s）

表1 EdU法检测miR-195转染后细胞增殖能力（s）

注：与阴性对照组比较，aP＜0.05

miR-195转染组 6 25.01 ±0.728a阴性对照组 6 37.49 ±1.568 F值 - 4.634 P值 - ＜0.01

图5 各组细胞CDCA4蛋白表达水平（与阴性对照组相比，aP＜0.05）

miR-195属于miR-16家族，他拥有miR-16家族的核心序列：CGACGA。miR-195最早被报道在心肌肥厚的转基因小鼠体内高表达，并且能促进其向心力衰竭发展[10]。之后还有研究表明miR-195在癌组织中低表达，属于一种抑癌基因，能抑制癌细胞的增殖和促进凋亡的发生[11]。miR-195主要是通过与靶基因的3’非编码区结合来降解靶基因mRNA或抑制靶基因的翻译来发挥其作用。近年来对miR-195靶基因研究发现，它可以通过E2F2[12]、Bcl-2[11]、BNDF[13]、FLT3[14]、Arl2[15]等这些靶点发挥作用。虽然miR-195是在心肌肥厚的小鼠体内最早被报道，但是大部分研究都是关于其与肿瘤之间的关系，它与心血管疾病报道相对较少，本实验研究发现miR-195在心衰患者的血清中表达水平明显提高，推测可能是miR-195对心肌功能有影响而导致心力衰竭的发生，或者是在某一个环节加重了心衰的可能性。对miR-195与心衰以及心肌细胞功能的研究更有利于找到适用于临床的研究办法，为心衰患者提供治疗的契机。

对于细胞增殖实验的检测，MTT方法简单快速，无放射性危险，但是只能间接的说明细胞的增殖状态[16]，EdU相对更加灵敏，且背景很低，准确性高，但价格相对较贵。近年的研究表明EdU这种方法能高效快速直接反应细胞的增殖状态[7]。本实验最初利用MTT实验初步检测了miR-195对H9C2细胞的功能影响，发现其能抑制细胞增殖，为了得出更加精确的结果，再次做了EdU染色进一步分析miR-195对心肌细胞的影响，最终得出结论，miR-195能够抑制心肌细胞增殖。推测可能大量存在的miR-195在某种程度上抑制了心肌细胞的增殖，严重影响了心脏修复的能力，最终导致心脏功能失调引发了心衰。

通过利用在线生物信息学工具TargetScan分析之后发现，CDCA4可能是miR-195的1个直接靶基因。我们选择了CDCA4作为miR-195的候选靶基因，其主要原因主要有一下几点：①TargetScan、PicTar等靶基因预测网站均预测CDCA4为miR-195的靶基因；②CDCA4的3'-UTR区域包含miR-195的应答元件，且在不同物种中高度保守；③CDCA4可能在增殖及细胞周期中有重要作用[17]。本研究中发现，增加H9C2细胞miR-195的表达可使CDCA4蛋白表达明显减少，这表明miR-195可能通过影响CDCA4蛋白的表达以抑制H9C2细胞的增殖。但是，CDCA4是通过何种信号通路来调节细胞增殖，是否会引起细胞凋亡都有待进一步研究。

综上所述，在心衰患者血清中，miR-195表达量明显上调，且 miR-195能通过靶向调节CDCA4的表达从而抑制心肌细胞的增殖，其具体机制有待进一步探讨，miR-195或可能成为治疗心衰新的线索和靶点。

[1] Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association[J]. Circulation, 2014,129(3):399-410.

[2] Yancy CW,Jessup M,Bozkurt B,et al. 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J]. J Am Coll Cardiol, 2013,62(16):e147-e239.

[3] Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell,2004,116(2):281-97.

[4] Zhang X,Nie Y,Du Y,et al. MicroRNA-181a promotes gastric cancer by negatively regulating tumor suppressor KLF6[J]. Tumour Biol, 2012,33(5):1589-97.

[5] Troughton RW,Frampton CM,Yandle TG,et al. Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations[J]. Lancet,2000,355(9210):1126-30.

[6] Zhao Y,Samal E,Srivastava D. Serum response factor regulates a muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis[J].Nature, 2005,436(7048):214-20.

[7] Liu N,Bezprozvannaya S,Williams AH,et al. microRNA-133a regulates cardiomyocyte proliferation and suppresses smooth muscle gene expression in the heart[J]. Genes Dev,2008,22(23):3242-54.

[8] Matsumoto S,Sakata Y,Suna S,et al. Circulating p53-responsive microRNAs are predictive indicators of heart failure after acute myocardial infarction[J]. Circ Res,2013,113(3):322-6.

[9] Sygitowicz G,Tomaniak M,Blaszczyk O,et al. Circulating microribonucleic acids miR-1, miR-21 and miR-208a in patients with symptomatic heart failure: Preliminary results[J]. Arch Cardiovasc Dis,2015,108(12):634-42.

[10] van Rooij E,Sutherland LB,Liu N,et al. A signature pattern of stressresponsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(48):18255-60.

[11] Liu L,Chen L,Xu Y,et al. microRNA-195 promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity of human colorectal cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,400(2):236-40.

[12] Zhang QQ,Xu H,Huang MB,et al. MicroRNA-195 plays a tumorsuppressor role in human glioblastoma cells by targeting signaling pathways involved in cellular proliferation and invasion[J]. Neuro Oncol, 2012,14(3):278-87.

[13] Mellios N,Huang HS,Grigorenko A,et al. A set of differentially expressed miRNAs, including miR-30a-5p, act as posttranscriptional inhibitors of BDNF in prefrontal cortex[J]. Hum Mol Genet,2008,17(19):3030-42.

[14] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Meyer J,et al. New microRNAs from mouse and human[J]. RNA, 2003,9(2):175-9.

[15] Nishi H,Ono K,Iwanaga Y,et al. MicroRNA-15b modulates cellular ATP levels and degenerates mitochondria via Arl2 in neonatal rat cardiac myocytes[J]. J Biol Chem,2010,285(7):4920-30.

[16] 韩建群,修瑞娟. 两种细胞增殖分析方法的比较性研究[J]. 山东医药,2012,52(12):70-2.

[17] Zeng C,Pan F,Jones LA,et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system[J]. Brain Res,2010,1319:21-2.

本文编辑：刘璐鑫，田国祥

The expression of miR-195 in heart failure and its effect on proliferation of cardiac muscle cells

ZHANG Xian*, XIE Lian-hong, ZHU Xu-ting, LIN Lin, QU Yi.*Department of geriatric medicine, Central Hospital of Shanghai Xuhui District, Shanghai, 200031, China.

QU Yi; E-mail: 807079736@qq.com

Objective To investigate the expression of microRNA-195 (miR-195) in heart failure and the effects of miR-195 on the proliferation of H9C2 cells.MethodsThe expression of miR-195 of 56 heart failure patients and 40 normal serum specimens from March 2015 to July 2015 in Shanghai general hospital was detected by Taqman Real-time PCR. The miR-195 mimics was transfected into H9C2 cell by using Lipofectamine 2000. The ability of cell proliferation was detected by MTT and EdU assay. We compared the expression of miR-195 in serum and transfected cardiac muscle cells in patients with heart failure and normal subjects, analyzed of the effects of miR-195 on the proliferation and expression of CDCA4 in cardiac muscle cells.ResultsThemiR-195 was upregulated in serum of heart failure patients compared with normal people serum (P＜0.05)．MTT results showed that at 48, 72 and 96 hours after transfection, the absorbance of mimic miR-195 group was significantly lower than that of the negative control group (P＜0.05). Result of EdU assay showed that cell proliferation in transfected group was inhibited (P＜0.05). Result of Western blot results showed that miR-195 inhibited the expression of CDCA4 protein in cardiac muscle cells.ConclusionThe miR-195 have a higher expression level in serum of heart failure patients, and it could inhibit the proliferation of H9C2 cells by inhibiting the expression of CDCA4.

miR-195; Heart Failure; Proliferation; Cardiac muscle cells

R541.61

A

1674-4055(2017)01-0037-04

上海市徐汇区中心医院2015年度科研课题(2015XHYY-05)

1200031 上海,上海市徐汇区中心医院老年科

曲毅,E-mail:807079736@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.01.10