徐丹丹，王建发，张旭，刘东宇，许小楠，王乐，陈嘉，单旭菲，王晓雅，武瑞，杨彬

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

胞壁酰二肽对体外奶牛乳腺上皮细胞生长及胞内NOD2 mRNA表达的影响

徐丹丹，王建发，张旭，刘东宇，许小楠，王乐，陈嘉，单旭菲，王晓雅，武瑞，杨彬

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见，同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一，其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain, NOD）蛋白家族中的重要一员，通过识别其特异性配体胞壁酰二肽（muramyl dipeptide, MDP）——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分，而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells, BMEC）除泌乳以外，还是奶牛乳腺的免疫屏障。本试验欲探究MDP对BMEC体外生长状态及胞内NOD2表达量的影响。【方法】选取健康泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺腺泡为组织原材料，采用胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离BMEC；使用上皮细胞特异性表达的角蛋白-18（cytokeratin-18，CK-18）及成纤维细胞特异性表达的波形蛋白（Vimentin）抗体，通过免疫荧光技术对纯化后获得的细胞进行鉴定；将BMEC设为6个处理组，分别添加浓度为0（空白对照组）、1、5、10、15及20 μg·mL-1的MDP，24 h后显微镜下观察细胞状态，同时提取细胞RNA并反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR方法检测BMEC中NOD2的表达量。【结果】（1）胶原酶Ⅰ消化法结合梯度浓度胰蛋白酶纯化法分离得到的细胞CK-18免疫荧光结果为阳性，而Vimentin反应为阴性；……