黄建华，王晓姣，魏照辉，张震宇，孙付保

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造

黄建华，王晓姣，魏照辉，张震宇*，孙付保*

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

对以L-脯氨酸为底物，产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline, H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-ptrp2-H3P出发，通过易错PCR随机突变和定点突变处理，利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I，并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBT-R58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌，依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比，TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。

重组大肠杆菌；易错PCR；顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)；脯氨酸-3-羟化酶；定向改造

羟基-L-脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)是一种亚氨基酸，分子式为C5H9NO3，为L-脯氨酸经过羟基化后得到的产物。由于L-脯氨酸有2个不对称的碳原子，根据羟基所在位置的不同，形成的羟脯氨酸可以分为4种立体异构体，分别是反式-4-羟脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸和顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)。H3P在自然界中十分稀有[1]，现有资料报道其存在于产放线菌素、宜他霉素和远霉素等次级代谢物的微生物中[2]。H3P在医药[3-4]、化学合成[5]、不对称合成等领域有着较广泛应用[6]。但其含量的稀少成为限制其应用的最主要因素。……