张小宁 庄建

综 述

移植静脉病基因治疗基础研究和临床应用

张小宁 庄建

作者单位：510080 广东省广州市，广东省医学科学院广东省人民医院心外科

移植静脉病； 基因治疗

自体静脉是动脉重建术的常用材料。然而，自体静脉移植术后，由于自体静脉经受缺血、损伤、炎症反应和承受动脉血的高压等因素，早期可能出现移植静脉痉挛、栓塞，随后可产生移植静脉内膜增生和粥样硬化，偶见血管瘤，这些现象统称为移植静脉病（vein graft disease），其严重影响着冠脉搭桥术（coronary artery bypass grafting，CABG）和外周血管疾病术后的临床效果。因移植静脉在离体后可先进行基因转染，然后移植，所以从理论上讲移植静脉是理想的基因治疗靶标，移植静脉病基因治疗成为心血管外科研究的前沿。本文就移植静脉病基因治疗相关基础研究与临床应用进行总结。

1 移植静脉病基因治疗的目标基因及其作用机制

1.1 抑制炎症细胞及炎症因子 炎症细胞（单核细胞和白细胞）浸润，巨噬细胞大量炎症因子释放，是导致移植静脉病的关键因素，许多基因治疗方案是针对这一机制设计的。Chen等[1]于1994年首先报道腺病毒介导可溶性血管细胞黏附分子（soluble vascular cell adhesion molecule，sVCAM） 转基因治疗移植静脉病，虽未取得阳性治疗结果，但成功地将sVCAM基因转染了移植静脉，拉开了基因治疗移植静脉病的序幕。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）均可促使一氧化氮（nitric oxide，NO）的合成，而NO具有抑制炎症细胞和抑制血管平滑肌细胞增生等重要生理作用。多项研究显示，eNOS和iNOS转基因有效地抑制了炎细胞和移植静脉内膜增生，起到了防治移植静脉病的作用[2]。金属蛋白酶（metalloproteinases，MMPs）介导血管平滑肌细胞移位增生，多项研究报道转染其抑制分子金属蛋白酶组织抑制剂 （tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、TIMP-2、TIMP-3基因，有效地抑制了血管平滑肌细胞增生和移植静脉内膜增厚[3,4]。研究显示，抗炎蛋白35K（soluble CC-CK binding protein）基因转染抑制了白细胞和单核细胞的积聚和移植静脉内膜增厚[5]。白细胞浸润和丝氨酸弹性蛋白酶活性可导致血管平滑肌细胞增生，转染选择性丝氨酸弹性蛋白酶抑制分子elafin基因有效地减低了早期炎症反应和延缓了移植静脉新内膜形成[6]。近年来研究显示，单核细胞趋化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）在移植静脉病中起关键作用，使用反义转基因技术直接抑制MCP-1基因表达及使用MCP-1受体的竞争性受体拮抗剂7ND（N-terminal deletion mutant of the MCP-1 gene）均可抑制巨噬细胞和移植静脉内膜增生[7]。研究[8]显示，基因转染CGRP抑制了巨噬细胞浸润及炎症因子MCP-1、肿瘤坏死因子-α（transforming growth factor-α，TNF-α）、iNOS、MMP-9 的表达，通过多种机制保护移植静脉，发挥防治移植静脉病的作用。使用反义转基因技术转染反义c-myc可抑制巨噬细胞和移植静脉内膜增生[9]。而使用反义转基因技术转染转化生长因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）可减低移植静脉内膜增生，MCP-1、胶原积聚，促使巨噬细胞凋亡，发挥防治移植静脉病的作用[10]。基因沉默技术在移植静脉病的基础研究中也得到应用。使用细胞间黏附因子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1） 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）成功地抑制了炎症因子ICAM-1的表达[11]；使用Midkine siRNA成功地抑制了炎症细胞和新内膜增生[12]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）在炎症调节中有重要作用。研究显示，使用NF-κB decoy下调NF-κB抑制了内膜增生和ICAM-1基因表达[13]。联合基因治疗也应用于移植静脉病治疗中。Turunen等[14]的研究显示，联合抗炎蛋白细胞外超氧化物歧化酶（extracellular superoxide dismutase，EC-SOD）+35K在减低巨噬细胞浸润方面比联合EC-SOD（extracellular superoxide dismutase）+TIMP-1 更有效，联合抗自由基、抗炎、抗增生基因可能更有效地减低新内膜形成，这可能因为两种不同基因从不同的分子生物学机制更有效地影响早期疾病形成的不同病理路径。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）抑制和改善慢性炎症和纤维化。有报道，使用轮状病毒介导HGF可达到抑制移植静脉病的作用[15]。

1.2 抑制血栓形成 血栓形成是移植静脉早期失败的主要因素，抑制血栓形成是防治移植静脉病提高移植静脉通畅率的有效方法。Kuo等[16]早在1998年就报道腺病毒介导组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，tPA）转基因有效地抑制移植静脉血栓形成。我国学者黄志雄等[17]报道腺病毒介导尿激酶原基因有效防止了血栓形成，抑制移植静脉内膜增厚，提高了移植静脉通畅率。Ohno等[18]报道腺病毒介导C-型利钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）抑制血栓形成和新内膜增生。有研究[19]结果显示，血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）转基因有效地抑制移植静脉血栓形成。

1.3 抑制细胞分裂 转录因子（transcription factor，E2F）参与细胞周期调控，基因转染E2F decoy可抑制表达c-myc、cdc2和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）基因，抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生[20]。有报道，基因转染microRNA-221、microRNA-145、早期生长反应因子-1的诱骗寡核苷酸（early growth response gene-1 decoy oligonucleotide，Egr-1 decoy ODN）、Jag1 及Girdin蛋白（girders of actin filaments）通过抑制血管平滑肌细胞增殖而取得了抑制移植静脉内膜增生的作用[21-25]。而最新研究显示，NF-κB和E2F嵌合体的decoy不仅抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生，而且可抑制巨噬细胞浸润和炎症因子释放[26]。β-肾上腺素能受体激酶抑制剂（carboxyl terminus of the Beta-adrenergic receptor kinase-1，β-ARKCT）可抑制细胞丝裂信号Gβγ，基因转染β-ARKCT基因抑制移植血管内膜增生[27]。Delta Rb控制细胞分裂G1/S相位转变，有报道显示，Delta Rb转基因抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生[28]。cdc2基因是有丝分裂的一个关键调节因子，没有cdc2的活性，细胞不能进入有丝分裂；PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用。基因转染反义cdc2和反义PCNA均报道抑制移植血管内膜增生[29]。有报道，逆转录病毒载体介导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）进行核糖核酸干扰（RNA interfere，RNAi），可将血管平滑肌细胞分裂停顿于G（0）/G（1）期，可抑制血管平滑肌细胞增殖和移植静脉内膜增生[30]。

1.4 抑制血管平滑肌细胞增殖 血管平滑肌细胞增殖是导致移植静脉内膜增生的开始。有报道[31]，基因转染第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN），可能通过抑制磷脂酰肌醇（-3）激酶信号通路，从而抑制血管平滑肌细胞增殖，达到抑制移植静脉内膜增生的目的。内皮素-1的合成激发血管平滑肌细胞增殖和加重新内膜增生。有报道[32]，通过使用转录因子活化剂蛋白-1诱捕基因寡脱氧核苷酸抑制前内皮素-1的合成，可达到减少新内膜形成的目的。激活素A，一个转化生长因子β超家族成员，可提高平滑肌细胞收缩表型。研究[33]显示，基因转染激活素A可减低移植静脉内膜增生。血小板衍生内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PDECGF）/胸苷磷酸化酶 （thymidine phosphorylase，TP）抑制血管平滑肌细胞移行和增殖。有报道[34]，基因转染PD-ECGF/TP可有效减低移植静脉内膜增生。研究[35]显示，基因转染Gax，过度表达Gax，可以诱导血管平滑肌细胞凋亡，从而发挥预防移植静脉病的作用。

1.5 调节细胞凋亡 诱导血管平滑肌细胞凋亡可能减少新内膜形成。基于这种想法，Wan等[36]用基因转染促凋亡基因p53，有效地抑制了移植静脉内膜增生。存活素（Survivin）是一种凋亡蛋白抑制剂。有趣的是，Wang等[37]的研究显示，在离体过度表达Survivin抑制炎症因子诱导的细胞凋亡，保护内皮细胞和血管平滑肌细胞；而基因转染Survivin有效抑制移植静脉内膜增生和细胞凋亡。

1.6 其他 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）上调血管损伤；在细胞培养中，通过基因转染反义碱性成纤维细胞生长因子（antisense basic fibroblast growth factor，ASbFGF）剂量相关地减低血管平滑肌细胞的生长效率；有报道在静脉移植中基因转染ASbFGF减低静脉移植血管剪切力，维持移植静脉管腔面积[38]。HSP20高度表达在血管平滑肌细胞，基因转染HSP20抑制血管平滑肌细胞收缩和血小板凝聚，抑制血管内膜增生，有望预防移植静脉病[39]。

总之，基因治疗目标基因从抑制炎症细胞及炎症因子、抑制血栓形成、抑制细胞分裂、抑制血管平滑肌细胞增殖、调节细胞凋亡等方面都有效地防治了移植静脉病。联合基因治疗、反义基因治疗、基因诱捕技术、基因干扰技术、基因沉默技术均应用到移植静脉病的基因治疗中，然而移植静脉病的分子生物学机制尚未完全明了，深入研究移植静脉病的分子生物学机制，选择针对移植静脉病分子生物学机制的基因，是今后移植静脉病基因治疗的研究方向。

2 移植静脉病基因治疗的基因转染技术

腺病毒、仙台病毒、脂质体、寡聚脱氧核苷酸和DNA寡聚物是移植静脉病研究中最常用的基因转染技术，然而这些载体表达时间短暂，短暂表达的载体不能适应移植静脉病长期预防的要求。逆转录病毒可持久表达，有报道逆转录病毒也成功地转染了移植静脉[30]，然而逆转录病毒具有潜在毒性、不能适合批量生产等缺陷。腺相关病毒载体在非人类灵长类动物中至少可以表达8年，在人类患者中有至少表达3.7年的报道，而且腺相关病毒载体安全、低毒、适合批量生产[40]。新近研究[41]表明，重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus，rAAV）可成功转染移植静脉，而经改造的重组腺相关病毒载体1型（rAAV1）进一步提高了基因转染效率[42]。Stachler和Bartlett[43]的研究显示，嵌合型重组腺相关病毒载体1型（rAAV1）50～100倍地增加了血管内皮细胞基因的转染效率，并认为嵌合型重组腺相关病毒载体1型很有希望在血管进行基因转染。我们成功地构建了嵌合型重组腺相关病毒（2/1），并成功地转染了移植静脉[8]。

3 移植静脉病基因治疗的临床应用和展望

Edifoligide，一种E2F转录因子诱捕基因，经过多项基础研究证明E2F decoy可以有效地抑制移植静脉病的进程[20]。Mann等[44]于1999年报道应用Edifoligide治疗冠脉旁路移植病，一期临床应用显示，有防治冠脉旁路移植病的趋向。但到2005年Alexander等[45]报道进行了四期3014例临床研究后显示，Edifoligide治疗冠脉旁路移植病不比安慰剂更有效。我们认为，在基础研究资料中仅研究了E2F decoy基因转染后2～4周的变化，而临床研究则观察基因转染12～18个月后的效果。在基因转染12～18个月后基因早已不再表达，基础与临床研究脱节，没有使用可以长期表达的基因转染载体是Edifoligide临床研究失败的主要原因。

总之，移植静脉病非常适合进行基因治疗。移植静脉病的基因治疗研究类似研究火箭，基因载体似火箭推进器，要求长期有效表达，且对人体无毒。选择合适基因似卫星，需要机制明确、效果良好。所以，选择最佳的可以长效表达的基因转染载体和针对移植静脉病的分子生物学机制的基因，是今后移植静脉病基础研究和临床应用的方向。

［1］Chen SJ，Wilson JM，Muller DW.Adenovirus-mediated gene transfer of soluble vascular cell adhesion molecule to porcine interposition vein grafts.Circulation，1994，89：1922-1928.

［2］Cable DG，Caccitolo JA，Caplice N，et al.The role of gene therapy for intimalhyperplasia ofbypass grafts.Circulation，1999，100：Ⅱ392-396.

［3］George SJ，Lloyd CT，Angelini GD，et al.Inhibition of late vein graft neointima formation in human and porcine models by adenovirus-mediated overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase-3.Circulation，2000，101：296-304.

［4］Akowuah EF，Gray C，Lawrie A，et al.Ultrasound-mediated delivery of TIMP-3 plasmid DNA into saphenous vein leads to increased lumen size in a porcine interposition graft model.Gene Ther，2005，12：1154-1157.

［5］Ali ZA，Bursill CA，Hu Y，et al.Gene transfer of a broad spectrum CC-chemokine inhibitor reduces vein graft atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice.Circulation，2005，112：Ⅰ235-241.

［6］O′Blenes SB，Zaidi SH，Cheah AY，et al.Gene transfer of the serine elastase inhibitor elafin protects against vein graft degeneration.Circulation，2000，102：Ⅲ289-295.

［7］李拥军，管珩，刘昌伟，等.反义单核细胞趋化蛋白-1基因抑制移植静脉内膜增殖的实验研究.中华外科杂志，2001，39：718-720.

［8］Zhang XN，Zhuang J，Wu HS，et al.Inhibitory effects of calcitonin gene-related peptides on experimental vein graft disease.Ann Thorac Surg，2010，90：117-123.

［9］Mannion JD，Ormont ML，Magno MG，et al.Sustained reduction of neointima with c-myc antisense oligonucleotides in saphenous vein grafts.Ann Thorac Surg，1998，66：1948-1952.

［10］Wolff RA，Malinowski RL，Heaton NS，et al.Transforming growth factor-beta1 antisense treatment of rat vein grafts reduces the accumulation of collagen and increases the accumulation of h-caldesmon.J Vasc Surg，2006，43：1028-1036.

［11］Walker T，Wendel HP，Tetzloff L，et al.Suppression of ICAM-1 in human venous endothelial cells by small interfering RNAs.Eur J Cardiothorac Surg，2005，28：816-820.

［12］Banno H，Takei Y，Muramatsu T，et al.Controlled release of smallinterferingRNA targetingmidkineattenuatesintimal hyperplasia in vein grafts.J Vasc Surg，2006，44：633-641.

［13］胡新华，杨军，张强，等.核转录因子κB decoy寡核苷酸对移植静脉内膜增生的影响.中华外科杂志，2003，41：684-687.

［14］Turunen P，Puhakka HL，Heikura T，et al.Extracellular superoxide dismutase with vaccinia virus anti -inflammatory protein 35K or tissue inhibitor of metalloproteinase-1：Combination gene therapy in the treatment of vein graft stenosis in rabbits.Hum Gene Ther，2006，17：405-414.

［15］Zhong JT，Chang Q，Sun Y，et al.Lentiviral vector mediated expression of Bax and hepatocyte growth factor inhibitsvein graft thickening in a rabbit vein graft model.Pharmazie，2014，69：809-813.

［16］Kuo MD，Waugh JM，Yuksel E，et al.The potential of in vivo vascular tissue engineering for the treatmentofvascular thrombosis：a preliminary report.American Roentgen Ray Society.AJR Am J Roentgenol，1998，171：553-558.

［17］黄志雄，郭少先，郭加强，等.尿激酶原基因防止静脉桥血栓形成的实验研究.中华外科杂志，1998，36：122-125.

［18］Ohno N，Itoh H，Ikeda T，et al.Accelerated reendothelialization with suppressed thrombogenic property and neointimal hyperplasia of rabbit jugular vein grafts by adenovirus-mediated gene transferofC-type natriuretic peptide.Circulation，2002，105：1623-1626.

［19］Kim AY，Walinsky PL，Kolodgie FD，et al.Early loss of thrombomodulin expression impairs vein graft thromboresistance：implications for vein graft failure.Circ Res，2002，90：205-212.

［20］Ehsan A，Mann MJ，Dell′Acqua G，et al.Endothelial healing in vein grafts：proliferative burst unimpaired by genetic therapy of neointimal disease.Circulation，2002，105：1686-1692.

［21］Wang XW，He XJ，Lee KC，et al.MicroRNA-221 sponge therapy attenuates neointimal hyperplasia and improves blood flows in vein grafts.Int J Cardiol，2016，208：79-86.

［22］Ohnaka M，Marui A，Yamahara K，et al.Effect of microRNA-145 to prevent vein graft disease in rabbits by regulation of smooth musclecellphenotype.JThoracCardiovascSurg，2014，148：676-682.

［23］Wang X，Mei Y，Ji Q，et al.Early growth response gene-1 decoy oligonucleotidesinhibitvascularsmooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia of autogenous vein graft in rabbits.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2015，21：50-54.

［24］Zhou X,，Xiao Y，Mao Z，et al.Soluble Jagged-1 inhibits restenosis of vein graft by attenuating Notch signaling.Microvasc Res，2015，100：9-16.

［25］Miyachi H，Takahashi M，Komori K.A Novel Approach against Vascular Intimal Hyperplasia Through the Suppression of Girdin.Ann Vasc Dis，2015，8：69-73.

［26］Miyake T，Aoki M，Morishita R.Inhibition of anastomotic intimal hyperplasia using a chimeric decoy strategy against NFkappaB and E2F in arabbitmodel.CardiovascRes，2008，79：706-714.

［27］Huynh TT，Iaccarino G，Davies MG，et al.Adenoviralmediated inhibition of G beta gamma signalinglimitsthe hyperplasticresponse in experimentalvein grafts.Surgery，1998，124：177-186.

［28］Lamfers ML，Aalders MC，Grimbergen JM，et al.Adenoviral delivery of a constitutively active retinoblastoma mutant inhibits neointima formation in a human explant model for vein graft disease.Vascul Pharmacol，2002，39：293-301.

［29］Mann MJ，Gibbons GH，Tsao PS，et al.Cell cycle inhibition preserves endothelial function in genetically engineered rabbit vein grafts.J Clin Invest，1997，99：1295-1301.

［30］胡新华，张强，杨军，等.RNA干扰沉默哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白基因表达对大鼠血管平滑肌细胞增殖活性及移植血管内膜增生的影响.中华医学杂志，2007，87：58-62.

［31］Hata JA，Petrofski JA，Schroder JN，et al.Modulation of phosphatidylinositol 3 -kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts.J Thorac Cardiovasc Surg，2005，129：1405-1413.

［32］Kusch B，Waldhans S，Sattler A，et al.Inhibition of carotis venous bypass graft disease by intraoperative nucleic acid-based therapy in rabbits.Thorac Cardiovasc Surg，2006，54：388-392.

［33］Kloppenburg GT，Grauls G，Bruggeman C，et al.Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in arat model.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2009，8：31-34.

［34］Handa M，Li W，Morioka K，et al.Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft.J Vasc Surg，2008，48：1566-1574.

［35］郑辉，薛松，连锋，等.腺病毒介导Gax基因对血清刺激后兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响.细胞与分子免疫学杂志，2012，28：33-36.

［36］Wan S，George SJ，Nicklin SA，et al.Overexpression of p53 increases lumen size and blocks neointima formation in porcine interposition vein grafts.Mol Ther，2004，9：689-698.

［37］Wang GJ，Sui XX，Simosa HF，et al.Regulation of vein graft hyperplasia by survivin,an inhibitorofapoptosisprotein.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25：2081-2087.

［38］Hanna AK，Durán WN，Leconte I，et al.Adenoviral-mediated expression of antisense RNA to basic fibroblast growth factor reduces tangential stress in arterialized vein grafts.J Vasc Surg，2000，31：770-780.

［39］McLemore EC，Tessier DJ，Flynn CR，et al.Transducible recombinant small heat shock-related protein，HSP20，inhibits vasospasm and platelet aggregation.Surgery，2004，136：573-578.

［40］Gray SJ，Samulski RJ.Optimizing gene delivery vectors for the treatment of heart disease.Expert Opin Biol Ther，2008，8：911-922.

［41］Kilian EG，Eifert S，Beiras-Fernandez A，et al.Adenoassociated virus-mediated gene transfer in a rabbit vein graft model.Circ J，2008，72：1700-1704.

［42］Sen S，Conroy S，Hynes SO，et al.Gene delivery to the vasculature mediated by low-titre adeno-associated virus serotypes 1 and 5.Gene Med，2008，10：143-151.

［43］Stachler MD，Bartlett JS.Mosaic vectors comprised of modified AAV1 capsid proteinsforefficientvectorpurification and targeting to vascular endothelial cells.Gene Ther，2006，13：926-931.

［44］Mann MJ，Whittemore AD，Donaldson MC，et al.Ex-vivo gene therapy of human vascular bypass grafts with E2F decoy：the PREVENT single-centre，randomised，controlled trial.Lancet，1999，354：1493-1498.

［45］Alexander JH，Hafley G，Harrington RA，et al.PREVENT ⅣInvestigators.Efficacy and safety ofedifoligide，an E2F transcription factor decoy，for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery：PREVENTⅣ：a randomized controlled trial.JAMA，2005，294：2446-2454.

Basic research and clinical application of gene therapy for vein graft disease

Vein graft disease； Gene therapy

张小宁，E-mail：xiaoningzhang@msn.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．02．005

R654.2

A

1672-5301（2017）02-0113-05

2016-06-29）