罗 阳，杨 敏，唐嘉熙，王朝霞，李婷婷△

1.成都医学院 药学院(成都 610083)；2.河北滦县妇幼保健计划生育服务中心(滦县 063700)

·论 著·

响应面法在超声提取怀菊总黄酮条件优化中的应用*

罗 阳1，杨 敏2，唐嘉熙1，王朝霞1，李婷婷1△

1.成都医学院 药学院(成都 610083)；2.河北滦县妇幼保健计划生育服务中心(滦县 063700)

目的 研究超声法提取怀菊中总黄酮的优化工艺。方法 利用响应面法，分析怀菊和乙醇的料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间和提取次数对怀菊提取物中总黄酮含量的影响，得出最佳参数组合并建立多元回归模型。结果 最佳提取工艺为：怀菊与乙醇的料液比1∶14、乙醇浓度65%、置于55 ℃下的恒温超声仪中提取3次。结论 响应面法可以用于怀菊总黄酮提取条件的优化。

怀菊；总黄酮；超声提取；响应面法

药用菊花，以产于河南焦作的“怀菊”Chrysan-themummorifoliumRamat．最为有名，是四大怀药之一，具有疏风清热、平肝明目、解毒之功效。近年研究[1]发现，其含有丰富的黄酮类化合物，具有明显的抗炎、抗菌、抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基、增加机体免疫力和扩张冠状动脉等作用。用怀菊浸出物治疗冠心病，有效率达58%以上，尤其对伴有高血压、心绞痛的患者有很好的疗效。近年来黄酮类化合物的研究更多涉及到提取工艺的应用研究、黄酮类化合物的含量测定及制剂制备上[2]。目前黄酮提取方法主要为有机溶剂回流法、超声法和微波提取等。超声提取能加速提取成分的扩散、释放，并能与溶剂充分混合而利于提取, 具有提取时间短、温度较低、收率高、适用性广、有效成分易于分离纯化、操作简单和成本低等优势[3-9]。影响超声法提取怀菊中黄酮的因素有：怀菊和提取溶剂乙醇的料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间和提取次数等，各因素影响大小不同，且存在一定的相互作用。本研究采用响应面分析法(response surface method,RSM)将统计设计与实验技术相结合，给出因素间相互作用的直观图形，得出优化工艺条件及回归模型[3]。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器厂)； DHG-9104A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限责任公司)；Biomate 3S双光束紫外可见分光光度计(东南科仪)；SC-3614型低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；HH-S66水浴锅(金坛市精达仪器制造厂)；KQ-300DE型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；BSA124S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

0.2 mg/mL芦丁对照品：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品20.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加入30%乙醇70 mL，水浴微热，使之溶解，自然冷却，再加入30%乙醇定容至刻度，摇匀备用。其中芦丁标准品(生化试剂)购于成都曼思特生物科技有限公司，其余所用试剂均为市售分析纯，试验用水为超纯水，怀菊采用市售普通怀菊，经成都医学院实验教学中心秦琴实验师鉴定为生药怀菊。

1.2 方法

根据单因素实验结果，怀菊的用量为3.00 g，改变提取溶剂乙醇的用量和浓度(40%～80%)，提取温度50～70 ℃，提取时间40～80 min，提取次数1～3次。利用 Design-Expert 7.1.6 软件，以A代表怀菊和乙醇的料液比，B代表乙醇浓度，C代表提取温度，D代表提取时间，E代表提取次数，Y代表提取物总黄酮含量(吸光度值)作为响应指标，由Box-Behnken中心组合进行五因素三水平实验，并优化其提取条件。

1.2.1 怀菊中总黄酮的超声波提取 精密称取干燥粉碎后的怀菊3.00 g于250 mL锥形瓶中，按照实验设计(表1)加入一定量对应浓度的乙醇，置于相应温度下的恒温超声仪中，提取相应的时间和次数。抽滤，将滤液离心30 min(3 500 r/min)后用0.45 μM滤膜过滤，量取2 mL于10 mL的容量瓶中，用相应浓度的乙醇定容至刻度，摇匀，得到供试液。

1.2.2 怀菊总黄酮的含量测定 以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法绘制标准曲线。精密量取芦丁对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分置25 mL容量瓶中，各加入5%NaNO2溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL摇匀，放置6 min；加4%NaOH溶液2 mL， 并分别加60%乙醇定容至刻度，摇匀、静置10 min，以吸光度为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标，在505 nm波长处进行测定，其含量与吸光值呈正比，得吸收曲线方程如式(1)，将怀菊供试液用上述方法在505 nm波长处测定吸光度，总黄酮含量按式(1)计算。

y=0.0113x+0.0284R2=0.9991

(1)

式中：y为对应的吸光度值；x为总黄酮的含量。

1.3 统计学方法

本研究采用Design Expert V10软件进行统计分析。采用单因素方差分析确定提取条件的取值水平，用响应面法建立多因素回归模型，确定最佳提取条件。检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 模型的适应性分析

表1设计了46个实验点，其中11，13，17，19，31，44号为零点实验，用来估算随机误差实验，其余40个点为析因实验点。对实验结果进行分析，得到提取物总黄酮含量(吸光度值，Y)与料液比(A)、乙醇浓度(B)、提取温度(C)、提取时间(D)、提取次数(E)之间的二次多项回归模型方程：

Y=0.27+0.034A-4.188E-003B-5.438E-003C-2.250E-003D+0.037E+0.015AB-4.500E-003AC+4.250E-003AD-1.250E-003AE+1.500E-003BC-6.000E-003BD+7.000E-003BE-8.750E-003CD+1.500E-003CE+2.000E-003DE-0.015A2-0.022B2-0.016C2+8.333E-005D2-9.667E-003E2

(2)

对回归方程进行方差分析和显著性检验，结果表明：模型的P<0.000，说明该回归模型极显著；失拟项的P=0.346，差异不显著，说明该模型拟合程度良好；决定系数(R2)和调整系数(adj.R2)分别为0.934和0.882，具有较好的一致性，表明该模型的准确性和适用性较好(表2)。因此，可以用该模型来分析和预测怀菊中总黄酮的超声波提取工艺。

2.2 不同因素及其交互作用对超声法提取怀菊中总黄酮的影响

料液比、提取次数、料液比的平方、乙醇浓度的平方、提取温度的平方、提取次数的平方以及料液比和乙醇浓度的交互作用均对怀菊中总黄酮的超声波提取有显著性的影响，差异有统计学意义(P<0.05)。回归模型系数表明，提取次数对提取物中总黄酮含量的影响最大，料液比的影响次之，其他因素的影响很小，且料液比和提取次数与总黄酮含量呈正相关。

图1-图10表明，提取物总黄酮含量(吸光度值，Y)随着料液比(A)增大而增加，呈现正交互作用，前半段增幅明显，后半段增幅较小。这是由于料液比扩大可增加怀菊与溶剂的接触面积，使黄酮类物质更充分地溶解出来；当提取溶剂乙醇足量后，细胞内外溶液中被溶解的化学成分浓度达到平衡，继续增大乙醇量而其提取液中黄酮含量无明显增加；料液比过大时会造成杂质过多溶出，使得进一步的浓缩消耗更多的能量和时间，同时也会阻碍黄酮的溶出[4]。因此，最适宜的料液比为1∶14。

表1 Box-Behnken中心组合实验设计及实验结果

表2 回归模型的方差分析及显著性检验

随着乙醇浓度(B)的升高，吸光度也随着升高，当乙醇浓度达到65%时，吸光度达到最大值；再增加乙醇浓度，吸光度下降。这可能是由于随乙醇浓度的增大，提取液中除黄酮外其他物质的提取率也随之提高，从而影响黄酮类物质的提取，造成怀菊总黄酮的提取率下降。因此，最适宜的乙醇浓度为65%。

随着提取温度(C)的升高，吸光度也随着升高，当温度达到55 ℃时，吸光度也达到最大值，再升高温度，吸光度下降。因为溶剂通过浸泡扩散作用将中药所含的化学成分逐渐溶解，使其扩散到溶剂中。渗透、溶解、扩散能力随温度升高而增大，从而提高提取率。但温度过高会破坏怀菊中的黄酮，温度的加大也会增加杂质的溶出。因此，最佳温度应为55 ℃。

随着提取时间(D)的延长，吸光度值缓慢升高，但增加的趋势不明显。当提取时间为80 min时，吸光度达到最大值，再增加提取时间，黄酮可能分解或挥发。因此，最适宜的提取时间为80 min。

随着提取次数(E)的增加，吸光度也随着升高，当提取次数为3次时，吸光度达到最大值。因此，最适宜的提取次数为3次。

图1 Y=f(A,B)的响应曲面

图2 Y=f(A,C)的响应曲面

图3 Y=f(A,D)的响应曲面

图4 Y=f(A,E)的响应曲面

图5 Y=f(B,C)的响应曲面

图6 Y=f(B,D)的响应曲面

图7 Y=f(B,E)的响应曲面

图8 Y=f(C,D)的响应曲面

图9 Y=f(C,E)的响应曲面

图10 Y=f(D,E)的响应曲面

2.3 模型验证实验

为验证模型预测的准确性，在A为1∶14、B为65%、C为55、D为80和E为3的条件下做3组平行实验，所得Y分别为0.320(25.81 μg /mL)，0.318(25.63 μg /mL)，0.321(25.89 μg /mL)，可见模型的预测效果较好。

3 讨论

黄酮类物质被包裹在细胞壁内，因此，要提高黄酮类物质的提取率，应先破坏细胞壁[1]。超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，促进提取溶剂乙醇溶液直接进入细胞内部，降低黄酮类物质溶出的阻力，缩短提取时间，提高黄酮类物质的溶出速率。

相对传统正交设计而言，响应面法可对影响因素组合进行更加精确的预测，从而得到更好的效果。采用响应面法优化怀菊中总黄酮的超声提取工艺，结果得出最佳工艺条件为：怀菊与乙醇的料液比1∶14、乙醇浓度65%、置于55 ℃下的恒温超声仪中提取3次，每次80 min。此条件下进行3次平行实验，平均提取黄酮含量为25.78 μg /mL，与理论预测值吻合。该研究结果可为怀菊开发成天然抗氧化功能性产品提供理论基础和科学依据。

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The Application of the Response Surface Method in the Ultrasonic Extraction of Total Flavonoids from Huai Flos Chrysanthemum

LuoYang1,YangMin2,TangJiaxi1,WangChaoxia1,LiTingting1△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.MaternalandChildHealthCareandFamilyPlanningServiceCenterofLuanxian,Luanxian063700,China

Objective To study the optimization of the process in the ultrasonic extraction of total flavonoids from Huai Flos Chrysanthemum. Methods The response surface method was adopted to analyze the effect of the Chrysanthemum-ethanol ratio, ethanol concentration, extraction temperature, extraction time and extraction times on the content of total flavonoids in chrysanthemum extraction. The obtained optimal parameter combination was used to establish the multiple regression model. Results The optimal extraction process was as follows: Chrysanthemum-ethanol ratio at 1:14, ethanol concentration at 65%, extraction temperature at 55℃ and exaction for 3 times. Conclusion The response surface method can be used to optimize the extraction conditions of total flavonoids from Huai Flos Chrysanthemum.

Huai Flos Chrysanthemum; Total flavonoids; Ultrasonic extraction; Response surface method

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161222.1043.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.022

成都医学院“大学生创新实验计划”(No:CXJS201305)；成都医学院自然科学基金(No:CYZ13-009)

R284

A

△通信作者：李婷婷，E-mail：93897556@qq.com