温 蓓，何 刚

四川省医学科学院.四川省人民医院 耳鼻喉科 (成都 610072)

·论 著·

FBXL20在喉癌组织中的表达及意义

温 蓓，何 刚△

四川省医学科学院.四川省人民医院 耳鼻喉科 (成都 610072)

目的 检测喉癌组织中FBXL20的表达，并探讨其与喉癌发生、发展的关系以及临床应用的潜在价值。方法 用免疫组化SP法，检测30例喉癌组织和其对应的正常组织中FBXL20的表达情况。结果 FBXL20表达于正常组织和肿瘤组织的胞浆中，相对于肿瘤组织，FBXL20在正常组织中表达较高(P=0.010)；其表达在有无侵犯淋巴结中，差异有统计学意义(P=0.042)；其表达在正常组织与低分化肿瘤中，差异有统计学意义(P=0.018)。结论 FBXL20在喉癌的发生中可能发挥着一定作用，并且可能是喉癌发生过程中的抑制因子。

喉癌；FBXL20；免疫组化

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，发病率呈逐年上升[1],在全世界常见的头颈部肿瘤中，位居第2，约占全世界所有肿瘤的1%～5%，并且常见于成年男性，在男性中发病率约为5.1/100 000[2]。喉癌的主要病理类型为鳞状细胞癌，约占所有喉癌的95%～98%[3]。 虽然喉癌的原因尚不明确，但普遍认为，这种癌症是由多种因素联合作用的结果，主要是环境和遗传因素[4]。流行病学研究[5]表明，吸烟和饮酒在喉癌的发展中发挥着重要作用。另外，研究喉癌相关的遗传因素，从分子遗传学的角度研究可能与喉癌发生发展相关分子，并通过相关性分析筛选可能的易感基因，在喉癌的发病机制研究中具有重要意义。

研究[6-7]发现，FBP家族的高表达与多种人类恶性肿瘤的不良预后有关，如肺癌、肾癌、食管癌和结肠癌。FBXL20作为FBP家族的成员，其在结直肠腺癌中表达水平高于正常组织，并且可能与肝癌的发生发展有关。同时，也有报道[8-9]显示，FBXL20与多种分子相关，并可能通过调节其相关分子发挥作用。尽管FBXL20 在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和睾丸癌等众多肿瘤中均有表达[7]，但其是否在喉癌中有表达，以及其表达高低与喉癌临床病理特征之间是否相关，至今很少研究。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

30例喉癌标本和其相对应的正常组织取自于2012～2016年所有四川省医学科学院.四川省人民医院的住院病人，30例喉癌病人一般资料如下(表1)。喉癌组织经病理检查均为鳞状细胞癌，其对应的正常组织经病理检查无癌组织。FBXL20兔抗人多克隆抗体(购于美国ABCAM公司)，SP免疫组化染色试剂盒和液体DAB酶底物显色试剂盒(购于北京中杉金桥生物技术有限公司)。

表1 30例喉癌病人的一般资料

1.2 免疫组化(SP法)

1.2.1 石蜡切片和SP法步骤 包埋好的石蜡切片常规切片4 μm,每例正常组织和肿瘤组织各切片5张：空白对照1张，HE染色1张，另外3张行FBXL20 SP法染色。石蜡切片常规二甲苯脱蜡2次( 10 min/次)后，梯度酒精水化(5 min/次)，然后3%过氧化氢10 min去除内源性过氧化物酶活性，水浴锅加热0.01 mmol/L枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至95 ℃左右，放入组织切片加热10～15 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次，5 min/次(0.01 M PBS，pH7.4)，37 ℃,山羊血清工作液孵育25 min。随后，滴加适当比例稀释的FBXL20抗体(1∶400，稀释液为磷酸盐缓冲液),4 ℃过夜。复温后，滴加生物素化二抗工作液,37 ℃,孵育1 h, 然后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃,孵育40 min。DAB显色，显微镜下观察显色合适后,自来水终止显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗后梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封闭。空白对照组与实验组步骤相同，只是FBXL20抗体用PBS代替。而HE染色是经过二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水，苏木素染色，盐酸酒精分化，伊红染色，自来水返蓝后,再经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封闭。

1.2.2 免疫组化结果观察 以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性组织作为阳性对照。FBXL20阳性判定：染色阳性以细胞浆呈现棕黄染色为标准，每张切片选择有代表性的区域，在100倍视野下进行计数，共计5个视野，取其平均值，避免随意性。FBXL20 的光密度(OD)值用图像分析软件Image ProPlus 进行分析，FBXL20表达强弱参考张鸣号等[10]报道的方法，根据染色的强度及阳性细胞的面积判断结果。每张切片阳性细胞的染色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别计分为0、1、2、3分；按阳性细胞面积分别计分为0(0%)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)、4(76%～100%)分。根据两项打分乘积判断结果：0分为阴性(-)，≤3分为阳性(+)，3～6分为中度阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法

2 结果

根据免疫组化结果，FBXL20在肿瘤组织和正常组织中都有表达，且多在胞浆中表达。在正常组织中，FBXL20的平均OD值为(0.199±0.091)，在肿瘤组织中为(0.162±0.072)。相对于正常组织来讲，FBXL20在肿瘤组织中表达下降(P=0.010)。同时，也分析了FBXL20的表达与临床病理参数如年龄、有无淋巴结转移及分化程度之间的关系。在年龄中，≤60岁患者肿瘤组织FBXL20的平均OD值为(0.177±0.069)，而在>60岁患者肿瘤组织中为(0.149±0.075)，差异无统计学意义(P=0.309)。在分化程度中，高分化患者肿瘤组织FBXL20平均OD值为(0.176±0.059)，与正常组织中FBXL20的表达差异无统计学意义(P=0.364)；中分化患者肿瘤组织FBXL20平均OD值为(0.171±0.070)，与正常组织中FBXL20的表达差异无统计学意义(P=0.413)；低分化患者肿瘤组织FBXL20的平均OD值为(0.091±0.078)，与正常组织中FBXL20 的表达差异有统计学意义(P=0.018)。在有无淋巴结转移方面，有淋巴结转移的患者，肿瘤组织中FBXL20的平均OD值为(0.153±0.069)，无淋巴结转移患者肿瘤组织FBXL20的平均OD值为(0.165±0.077)，差异有统计学意义(P=0.042)(表2)。

表2 FBXL20的表达与临床病理参数之间的关系±s)

3 讨论

浸润与转移是恶性肿瘤的重要特征，也是决定患者预后的关键因素。有学者[11]提出了恶性肿瘤浸润的三步学说，即黏附、降解和移动。 喉癌是高侵袭性的恶性肿瘤，其发生、发展是一个多基因、多阶段的演进过程[12]。

在已发现的FBP家族的100多个蛋白中， β-Trcp、 Skp2和Fbw7具有匹配下游底物特征的组件[9]，F-box其他蛋白在不同疾病中发挥着作用,例如：FBXO3在类风湿关节炎患者的增生滑膜中表达上调，当肌肉萎缩时，FBXO32表达上调[13]。FBXL20，作为FBP家族的一员，定位于17q12,全长10 381 bp,编码436个氨基酸。FBXL20的表达谱分析显示，该基因在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和睾丸癌等众多恶性肿瘤中均有表达，FBXL20的编码产物含有1个F-box的功能区[7]。

本研究中，通过SP法观察到，在30例喉癌组织和其相对应的正常组织中， FBXL20均有表达。在细胞水平，FBXL20多集中表达在胞浆中，当FBXL20呈强阳性表达时，其胞核也有表达。在组织水平，FBXL20主要集中表达于上皮组织、平滑肌和腺管中。通过分析得知，与肿瘤组织相比，FBXL20蛋白在正常组织中表达较高，意味着FBXL20表达水平的降低可能在喉癌的发生中有一定作用。FBXL20的表达与喉癌的低分化差异有统计学意义(P<0.05)，与高分化和中分化差异无统计学意义(P>0.05)，但FBXL20蛋白的OD值随着喉癌恶性程度的升高而逐渐下降，表明FBXL20的降低可能与肿瘤的发展有关。本研究观察到，FBXL20的表达与有无淋巴结转移有关，与无淋巴结转移的病例相比，FBXL20在淋巴结转移的病例中表达较低，预示着FBXL20蛋白表达水平的降低可能与肿瘤的转移有关。喉癌好发于男性，本研究30例病例中，男29例，女1例，故无法进行统计学分析。

综上所述，FBXL20蛋白表达水平的降低在喉癌的发生中可能发挥着一定作用，FBXL20可能是喉癌潜在的抑癌因子。

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网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161207.1049.008.html

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.016

The Expression and Significance of FBXL20 in Laryngeal Carcinoma Tissues

WenBei,HeGang△.

SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective To detect the expression of FBXL20 in laryngeal carcinoma tissues, analyze the correlation of the expression level of FBXL20 with the occurrence and development of laryngeal carcinoma and its potential value of clinical application. Methods The immunohistochemical SP method was used to detect the expression levels of FBXL20 in the caner tissues and the adjacent normal tissues of 30 patients with laryngeal carcinoma respectively. Results The positive protein expression of FBXL20 was observed in the cell nucleus of both cancer tissues and normal tissues, but the expression levels of FBXL20 in normal tissues were significantly higher than in cancer tissues (P=0.010). The expression of FBXL20 was correlated with the lymph node metastasis (P=0.042) and the poorly differentiated tumors (P=0.018). Conclusion FBXL20 may play a certain role in the occurrence of laryngeal cancer, and it may be a inhibitory factor in the occurrence of laryngeal cancer.

Laryngeal carcinoma; FBXL20; Immunohistochemistry

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161125.1109.016.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.015

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△通信作者：何刚，E-mail：heganghegang@live.cn