苏森森,郑 悦,高小洁,潘 渠

成都医学院 病原生物学教研室(成都 610500)

·论 著·

粪便乳杆菌FZB1菌株的益生特性研究*

苏森森,郑 悦,高小洁,潘 渠△

成都医学院 病原生物学教研室(成都 610500)

目的 研究粪便乳杆菌FZB1菌株的益生特性。方法 采用API 50 CH乳酸菌鉴定试剂条测定碳源利用能力。通过生长实验测定粪便乳杆菌FZB1菌株的耐酸性和对不同胆盐的耐受性。用荧光标记法，以人结肠癌细胞HT-29作为体外模型，研究粪便乳杆菌FZB1菌株的黏附性能及对病原菌大肠杆菌E57黏附抑制性能。结果 试验结果显示，粪便乳杆菌FZB1菌株可利用多种碳源和乳糖，耐受pH 3.0的酸度，可在0.4%牛磺石胆酸钠、0.08%胆酸钠、0.15%禽胆盐、0.15%脱氧胆酸钠、0.15%牛磺鹅脱氧胆酸钠和0.06%牛胆盐环境中生长。粪便乳杆菌FZB1菌株对HT-29细胞的黏附率可达88.7%，能通过竞争、排斥、置换作用阻止大肠杆菌E57的黏附，黏附率分别为86.4%、79.5%和47.8%。结论 粪便乳杆菌FZB1菌株具有降解乳糖、耐酸、耐胆盐和在肠道定植黏附的能力，适合在鸡、鸭、鹅等家禽肠道中发挥益生作用。

益生菌；乳杆菌；黏附；益生特性

乳杆菌(Lactobacillus) 是一类安全无害的微生物，可黏附在肠道中，在肠道内繁殖，具有维持动物肠道内菌群平衡、促进营养物质吸收、增强机体免疫力等特性，能对机体营养状态、免疫反应、生理功能等产生积极作用[1-2]，是重要的胃肠道益生菌。近年研究[3-6]发现肠道中的乳杆菌不仅对胃肠道环境发挥着益生作用，而且相关研究报道受试者服用长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriainfantis)等乳杆菌后， 宿主焦虑、抑郁、自闭、强迫症等异常的心理精神症状得到改善，心理平衡得到维持，大脑学习和记忆能力增强，证实了补充乳杆菌可能成为预防和治疗精神类疾病、改善宿主心理健康和促进脑功能的安全有效措施。益生菌适应肠道环境，具有耐胆盐的能力。胆盐种类有：胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺石胆酸钠和牛磺鹅脱氧胆酸钠等。不同动物肠道的胆盐种类和浓度是不同的[7-9]，鸡、鸭、鹅等家禽肠道中富含牛磺鹅脱氧胆酸钠而没有脱氧胆酸钠，牛、羊等草食性动物的肠道中却富含脱氧胆酸钠且牛磺鹅脱氧胆酸钠含量低下。益生菌对不同胆盐的耐受性可能决定了它的宿主特异性。

粪便乳杆菌(Lactobacillusfaecis)是2013年发现的乳杆菌新种，分离自南非开普敦动物园中的豺和浣熊的粪便， 模式种为AFL13-2T(=JCM 17300T=DSM23956T)[10]。笔者从四川省富顺县的白鹭粪便样品中分离鉴定到了1株粪便乳杆菌菌株FZB1[11],现已保存至中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 10515。目前对粪便乳杆菌的益生特性尚未有研究，本研究对粪便乳杆菌FZB1菌株的碳源利用能力、耐酸性、对不同种类胆盐的耐受性、肠道黏附和拮抗病原菌能力进行了实验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

试验菌株粪便乳杆菌FZB1、台湾福菜乳杆菌YM0097、白色葡萄球菌CICC10897和大肠杆菌E57由成都医学院实验室保存；人结肠癌细胞系HT-29购自成都尚博生物试剂有限公司；胆盐购自上海生工公司；异硫氰酸荧光素(FITC) 购自索莱宝公司；MoCoy′s Medium(1X) modified 培养液、0.25% 胰酶(EDTA)、胎牛血清(草原绿野生物)、细胞培养瓶及培养板均购自成都豪乙生物科技有限公司；细胞培养箱、酶标仪、高速冷冻离心机购自美国Thermo公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株碳水化合物代谢分析 采用API 50 CH 乳酸菌鉴定试剂条对粪便乳杆菌FZB1菌株进行碳源底物的利用能力测定。发酵后48 h观察颜色的变化，由紫色变为黄色判为阳性。对照为福菜乳杆菌YM0097菌株。

1.2.2 耐酸实验 将连续2次活化后的菌株按4.0%(v/v)接种量，分别接种于pH 6.6、 2.0、3.0 的MRS、LB 液体培养基中，混匀后放置于37.0 ℃厌氧培养箱、摇床中培养，于0、1、2、3 h取样，并作10倍浓度稀释，耐酸实验组和对照组均稀释至10-5进行平行平板涂布,培养48 h后,观察进行菌株生长情况[12]。

1.2.3 耐胆盐实验 将连续活化2次后的粪便乳杆菌FZB1菌株、白色葡萄球菌CICC10897 按4.0%(v/v)接种量，分别接种于浓度含0.03%、0.06%、0.08%、0.15%、0.20%、0.30%、0.40% 的牛胆盐、牛磺石胆酸钠、胆酸钠、禽胆盐、脱氧胆酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠6种胆汁酸盐的MRS、LB 液体培养基中，混匀后放置于37.0 ℃厌氧培养箱、摇床中培养，于0、1、2、3 h取样，并作10倍浓度稀释，耐酸实验组和对照组均将浓度稀释至10-5进行平行平板涂布。经48 h 培养后，观察进行菌株生长情况[12]。

1.2.4 细胞黏附能力 1)菌液准备和细胞培养:将粪便乳杆菌FZB1菌株、台湾福菜乳杆菌YM0097 和大肠杆菌E57分别接种于MRS、LB 液体培养基中，于37.0 ℃培养箱中培养，再将生长至对数生长期的上述3株菌液，8 000 r/min 离心10 min(4 ℃)， 收集菌体，用无菌PBS 洗涤，将菌体重悬于PBS 缓冲液中。按照文献[13-14] 方法进行细菌荧光标记。向上述准备好的菌液中加入浓度为5.0 mg/mL异硫氰酸荧光素(FITC)中，用PBS 洗涤以去除未结合的FITC，将细菌悬浮于PBS 中，并调整细菌的终浓度为1.0×108CFU/mL[12]。HT-29细胞使用一次性培养瓶培养，向培养瓶中加入2 mL含10%热灭活的胎牛血清的MoCoy′s Medium细胞培养液，于37.0 ℃、5%CO2培养箱中培养。黏附实验时，将细胞接种于内含灭菌盖玻片的6孔培养板中, 细胞接种密度约为5.0×104CFU /mL，长至单层细胞后进行黏附试验。试验前用0.4%的台盼蓝染色液染色，用血细胞计数器在显微镜下检测细胞的数量和活性，保证细胞活性在95.0%以上[12]。2) 黏附试验:不加菌的细胞为空白对照，试验组加入1 mL培养液及l mL荧光标记的上述3株菌液，将培养板置于37.0 ℃、5%CO2培养箱中孵育1 h后，用无菌PBS 洗涤，洗脱未黏附的菌，再向每个培养孔中加入0.3 mL胰酶作用5 min，待细胞完全脱落，加入0.4 mL完全培养液终止反应。收集液体，用酶标仪测定其荧光强度。吸收光波长为485 nm，发射光波长为530 nm。计算公式：细菌黏附率(%)=100×A/A0。式中：A为3株菌黏附HT-29 细胞并洗脱后细胞悬液的相对荧光强度；A0为3株菌黏附 HT-29 细胞前细胞悬液的相对荧光强度[12]。3)黏附抑制试验:向12孔板每孔中加入以上调整好浓度的细胞悬液100 μL。通过荧光标记法，采用竞争、排斥和置换试验来研究粪便乳杆菌FZB1菌株和台湾福菜乳杆菌YM0097 对大肠杆菌E57的黏附抑制作用[12]。

竞争： HT-29细胞+粪便乳杆菌FZB1菌株/台湾福菜乳杆菌YM0097 (未标记)+大肠杆菌E57(FITC标记)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，离心去上清后，PBS洗涤3次，PBS重悬，转移至黑色的12孔板，避光静置。

排斥： HT-29细胞+粪便乳杆菌FZB1菌株/台湾福菜乳杆菌YM0097(未标记)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，离心去上清后，加入大肠杆菌E57(FITC标记)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，其余操作同上。

置换： HT-29细胞+大肠杆菌E57(FITC标记)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，离心去上清后，加入粪便乳杆菌FZB1菌株/台湾福菜乳杆菌YM0097 (未标记)，5%CO2、37.0 ℃共孵育1 h，其余操作同上。以上操作完成后，向每个培养孔中加入0.3 mL胰酶作用5 min，待细胞完全脱落，加入0.4 mL完全培养液终止反应。收集液体，用酶标仪测定其荧光强度。计算公式：黏附率(%)=100×A2/A1。式中：A1为无粪便乳杆菌存在的情况下，黏附在HT-29细胞上的大肠杆菌E57的相对荧光强度；A2为粪便乳杆菌存在的情况下，黏附在HT-29细胞上的大肠杆菌E57的相对荧光强度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 菌株碳水化合物代谢分析结果

两次实验重复后，结果表明，粪便乳杆菌FZB1菌株碳水化合物代谢分析结果与对照组福菜乳杆菌YM0097菌株相比较，发酵D-甘露醇、七叶灵、D-蜜二糖、D-海藻糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-木糖的试验结果不同，但实验结果在一定程度上证明了粪便乳杆菌FZB1菌株可发酵乳糖等碳源产酸，使肠道处于酸性环境，对大肠杆菌、变形菌等致病菌具有拮抗作用；其发酵乳糖的特性可用于缓解乳糖不耐受(表1)。

表1 粪便乳杆菌FZB1菌株碳源利用特征

注: (+)：阳性；(w)：弱阳性； (-)：阴性

2.2 粪便乳杆菌FZB1菌株耐酸试验结果

经48 h培养后，粪便乳杆菌FZB1菌株在pH 3.0 强酸环境中能够较好的存活；在pH 2.0强酸环境中，在1 h时仍能生长，其余时间段不生长。可见，粪便乳杆菌FZB1菌株可通过胃的酸性环境，顺利到达肠道(表2)。

表2 不同pH 条件下菌株的存活状态

注: (+)：有菌落生长； (-)：未长

2.3 粪便乳杆菌FZB1菌株耐胆盐试验结果

粪便乳杆菌FZB1菌株在不同动物来源、不同浓度的胆盐环境中表现出不同的生长状况。最高在浓度为0.06 %牛胆盐、0.4%牛磺石胆酸钠、0.08% 胆酸钠、0.15% 禽胆盐、0.15% 脱氧胆酸钠、0.15%牛磺鹅脱氧胆酸钠胆盐环境中生长(表3)。试验菌株粪便乳杆菌FZB1更适合在鸡、鸭、鹅等家禽肠道中生存，而不太适合在猪、羊、牛等家禽肠道中生存(表4)。

表3 胆盐耐受结果

注: (+)：有菌落生长； (-)：未长

表4 不同动物胆汁中胆汁酸成分

注: (+++)：主要成分；(++)：次要成分；(N)：尚不清楚

2.4 粪便乳杆菌FZB1菌株对HT-29细胞的黏附及对病原菌黏附的抑制

粪便乳杆菌FZB1菌株对小肠上皮细胞HT-29具有很强的黏附能力，黏附率可达88.7%，比对照组台湾福菜乳杆菌标准株YM0097高11.8%，且能通过置换作用阻止大肠杆菌E57的黏附,相对置换率达9.9%，竞争或排斥作用总体上能促进大肠杆菌E57对肠上皮细胞的黏附作用。福菜乳杆菌标准株YM0097能通过竞争、排斥、置换3种方式促进大肠杆菌E57对肠上皮细胞的黏附作用。

表5 粪便乳杆菌FZB1菌株对HT-29细胞黏附以及对大肠杆菌E57黏附的影响

菌株黏附试验竞争试验排斥试验置换试验E5757.7±2.0257.7±2.0257.7±2.0257.7±2.02FZB188.7±1.01*86.4±1.7379.5±1.9547.8±1.04*YM009776.9±2.6572.1±3.4565.7±2.1264.1±1.83

注:与E57相比，*：P<0.01；无标注：P<0.05

3 讨论

不同动物的胃肠道环境本身存在一定差异性。在碳水化合物代谢实验中，对照组福菜乳杆菌YM0097菌株的试验结果符合既往研究[15]的报道，粪便乳杆菌FZB1菌株的结果也基本符合粪便乳杆菌模式种AFL13-2T(=JCM 17300T=DSM23956T)的生化试验结果[10]，仅发酵D-半乳糖和水杨酸、D-甘露醇、熊果苷和D-海藻糖的试验结果不同，推测这一差异可能与菌株来源于不同动物有关(表1)。肠道中胆盐的质量分数在0.03%～0.30% 范围波动。所以本次试验设计胆盐试验浓度最高为0.4%，结合表4可知，不同动物来源肠道中胆汁、胆汁酸主要成分各不相同，针对此种情况进行了试验设计。试验结果显示，最高在浓度为0.06%牛胆盐、0.4%牛磺石胆酸钠、0.08% 胆酸钠、0.15% 禽胆盐、0.15% 脱氧胆酸钠、0.15% 牛磺鹅脱氧胆酸钠胆盐环境中生长，结合表4，脱氧胆酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠主要存在于鸡、鸭、鹅等胆汁酸中；牛胆盐主要存在于猪、牛胆汁酸中；牛磺石胆酸钠主要存在于熊和人类胆汁酸中；胆酸钠主要存在于狗、鸭、鹅、猪、羊、牛胆汁酸中[7-9]。综合试验结果表明，试验菌株粪便乳杆菌FZB1在鸡、鸭、鹅等家禽肠道中表现出良好的胆盐耐受性，而在猪、羊、牛等家禽肠道中表现出的胆盐耐受性欠佳，对不同动物来源胆盐耐受性表现出差异，推测不同动物肠道需要不同的益生菌来适应。

益生菌除了能耐受低pH 和高胆盐的能力外，还必须能在肠道中定植黏附，这是益生菌能在肠道发挥益生作用的关键。因此本研究使用体外培养 HT-29细胞的方法来评价这株菌株的黏附能力及其对大肠杆菌 E57黏附抑制作用。研究发现，粪便乳杆菌FZB1菌株对小肠上皮细胞HT-29具有很强的黏附能力，黏附率可达88.7%，比研究[16]报道的格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)对小肠上皮细胞Caco-2黏附率高约13.4%，但格氏乳杆菌却能通过排斥作用阻止病原菌大肠杆菌K88的黏附，排斥率达58.0%；比白洁等[12]报道的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、食果糖乳杆菌(Lactobacillusfructivorans)对Caco-2细胞黏附率超出31.0%,12.0%左右，比鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)通过置换作用减少鼠伤寒沙门氏菌黏附的相对置换率低17.5%；比食果糖乳杆菌(Lactobacillusfructivorans)通过置换作用减少鼠伤寒沙门氏菌黏附的相对置换率高1.7%；郭彤等[17]研究发现，嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌黏附Caco-2细胞的数量在1 h内基本达到饱和，且对病原菌K88和猪霍乱沙门氏菌生长均有很强的抑制作用,抑制率均达到100%。可见，不同的益生菌对小肠上皮细胞和对病原菌黏附抑制作用表现出差异。实验结果在一定程度上证明了粪便乳杆菌FZB1菌株对小肠上皮细胞HT-29具有很强的黏附能力，对病原菌大肠杆菌E57黏附抑制作用也较好。

综上所述，笔者初步认为，分离得到的粪便乳杆菌FZB1菌株具备降解乳糖、耐酸、耐胆盐、能在杂食类动物如鹅、鸭、鸡的肠道定植黏附的能力。随着对其益生特性的深入研究，此菌株将有希望作为益生菌，不仅可以维持肠道微生态环境平衡，还可以将其以饲料添加剂的形式运用到杂食类动物如鹅、鸭、鸡的养殖中，促进国内微生物饲料添加剂的蓬勃发展。

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A Study on the Probiotic Properties of FZB1 Strains of Lactobacillus Faecis

SuSensen,ZhengYue,GaoXiaojie,PanQu△.

DepartmentofPathogenicBiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To analyze the probiotic properties of FZB1 stains ofLactobacillusfaecis. Methods The API 50 CH system was used to determine the utilization of carbon sources. The growth experiment was adopted to detect the FZB1 stains′ acid tolerance and their tolerance to different bile salts. The fluorescence labeling method was used to investigate the adhesive properties and the inhibitory effect on the adherence of pathogen with the HT-29 cell line as an in vitro model. Results The results showed that the FZB1 stains ofLactobacillusfaeciswere capable of using various carbon sources and lactose, being resistant to pH 3.0, and growing in 0.4% taurolithocholic acid sodium, 0.08% sodium cholate, 0.15% poultry bile salt, 0.15% sodium deoxycholate, 0.15% taurocholate chenodeoxycholic acid sodium and 0.06% bile salt respectively. The results of adhesion showed that the rate of the FZB1 strains′ adhesion to the HT-29 cell line was 88.7%, and the FZB1 strains inhibited the adhesion ofEscherichiacoliE57by means of competition, exclusion and replacement with the adhesion rates of 86.4%, 79.5% and 47.8% respectively. Conclusion The FZB1 strains ofLactobacillusfaecisis capable of lactose degradation, acid tolerance, bile salt tolerance and adhesion to intestinal colonization, and their probiotic properties have a beneficial effect on the intestines of the poultry such as chicken, ducks, geese, etc.

Probiotics;Lactobacillus; Adhesion; Probiotic property

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161125.1106.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.001

国家自然科学基金面上项目资助(No:31170007)；四川省教育厅科技基金重点项目资助(No:14ZA0219)

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△通信作者：潘渠，E-mail: ppqlove@126.com