硫氢化钠对肝硬化大鼠肝细胞凋亡及肝组织Bax、Bcl-2表达的影响

2017-01-06刘浩陈卫刚郑勇

山东医药 2016年44期

关键词：硫化氢肝细胞腹腔

刘浩，陈卫刚，郑勇

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832008)

硫氢化钠对肝硬化大鼠肝细胞凋亡及肝组织Bax、Bcl-2表达的影响

刘浩，陈卫刚，郑勇

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832008)

目的探讨硫氢化钠(NaHS)对肝硬化大鼠的肝保护作用及其机制。方法选择雌性SD大鼠40只，随机分为正常对照组、肝硬化组、炔丙基甘氨酸(PPG)组、NaHS组，每组10只。肝硬化组、PPG组、NaHS组采用四氯化碳复合因素法制备肝硬化模型。PPG组腹腔注射PPG 30 mg/(kg·d)，NaHS组腹腔注射NaHS 56 μmol/(kg·d)，正常对照组和肝硬化组腹腔注射等量生理盐水，共注射7天。末次注射次日处死大鼠，留取肝组织，免疫组化法检测肝组织Bax、Bcl-2表达,脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法测定肝细胞凋亡指数(AI)。结果肝组织Bax、Bcl-2蛋白均定位于细胞质，染色后呈棕黄色颗粒状，凋亡肝细胞细胞核呈棕黄色或黄褐色。与正常对照组比较，肝硬化组AI明显升高(P<0.05)；与肝硬化组比较，NaHS组Bax表达及AI均明显降低(P均<0.05)，PPG组Bax表达及AI均明显升高(P均<0.05)；各组间Bcl-2表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 NaHS对肝硬化大鼠具有肝保护作用，可抑制肝细胞凋亡；其机制可能与下调Bax表达有关。

肝硬化；硫氢化钠；硫化氢；细胞凋亡；Bax；Bcl-2

硫化氢(H2S)是继NO、CO之后发现的第三种新型气体信号分子，在体内主要通过细胞胱硫醚β合成酶(CBS)、细胞胱硫醚γ裂解酶(CSE)催化L-半胱氨酸而产生，具有扩张血管、心肌保护、抗炎等作用[1～4]。近年研究发现，其在肝纤维化及门脉高压的发生、发展过程中具有重要作用[5～9]。本课题前期研究证实，腹腔注射硫氢化钠(NaHS)可改变大鼠体内H2S的含量。2013年6月～2014年1月，我们观察了NaHS对肝硬化大鼠肝细胞凋亡及肝组织Bax、Bcl-2表达的影响，现分析结果，探讨NaHS在肝硬化发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料健康、SPF级、雌性SD大鼠40只，体质量(210±10)g，购自新疆医科大学实验动物中心，为同期出生的纯种系。饲养环境：温度20～25 ℃，湿度50%左右。主要仪器：RM2135型石蜡切片机，德国LEICA公司；免疫组化图像分析系统，日本OLYMPUS株式会社。主要试剂：兔抗鼠Bcl-2多克隆一抗，英国Abcam公司；兔抗鼠Bax多克隆一抗，武汉博士德生物工程有限公司；脱氢核苷酸末端转移酶介导缺口端标记(TUNEL)试剂盒，瑞士Roche公司；二抗检测试剂盒，北京中杉金桥有限责任公司；硫氢化钠(NaHS)、炔丙基甘氨酸(PPG)，美国Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 模型制备及干预将40只大鼠随机分为正常对照组、肝硬化组、PPG组、NaHS组，每组10只。肝硬化组、PPG组、NaHS组采用四氯化碳复合因素法制备肝硬化模型：大鼠适应性喂养1周，皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，首次剂量为0.5 mL/100 g，以后每隔4天注射1次，剂量为0.3 mL/100 g，共注射13次。造模期间各组以30%乙醇溶液作为惟一饮用液体；前2周用20%猪油+80%玉米面饲养，之后用0.5%胆固醇粉+玉米面饲养至造模结束。正常对照组同期皮下注射等量生理盐水，喂养饲料为复合饲料，饮用水为自来水。52天后处死大鼠，肝硬化组、PPG组、NaHS组均造模成功。造模结束PPG组腹腔注射PPG 30 mg/(kg·d)，NaHS组腹腔注射NaHS 56 μmol/(kg·d)，正常对照组、肝硬化组同期腹腔注射等量生理盐水，共注射7天。

1.3 相关指标观察

1.3.1 肝组织Bax、Bcl-2蛋白表达采用免疫组化法。末次注射次日采用颈椎脱臼法处死大鼠，取部分肝组织置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片常规脱蜡至水，3%双氧水甲醇中浸泡10 min。枸橼酸修复液微波炉中高火修复至冒泡后再低火修复20 min，冷却至室温，加Bax、Bcl-2一抗，置于4 ℃冰箱过夜。次日PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗(两步法)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。Bax、Bcl-2蛋白表达阳性部位在细胞质，显棕黄色。每张标本切片随机选择5个高倍视野区域，计数阳性细胞数和总细胞数，计算阳性表达率。阳性表达率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.3.2 肝细胞凋亡指数(AI) 石蜡切片常规脱蜡至水，3%双氧水甲醇中浸泡10 min，PBS冲洗5 min×3次；蛋白酶K(15 μg/mL)37 ℃温箱中孵育7 min；20%胎牛血清室温下封闭20 min；用滤纸吸去残留液后滴加反应液50 μL(TdT 3 μL，荧光素连接的核苷酸混合缓冲液47 μL，阴性对照片不加TdT)，37 ℃温箱中孵育45 min，PBS冲洗5 min×3；20%山羊血清室温下封闭20 min，加POD转换剂(原液1∶2稀释)，置于37 ℃温箱中孵育30 min，显微镜下DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性部位在细胞核，显棕黄色或棕褐色。计数5个高倍镜视野下100个肝细胞核中阳性细胞的个数，取其均值为AI。

2 结果

各组肝组织Bax、Bcl-2蛋白均定位于细胞质，染色后呈颗粒状棕黄色。见插页Ⅰ图4、5。与正常对照组比较，肝硬化组AI明显升高(P<0.05)；与肝硬化组比较，NaHS组Bax表达及AI均明显降低(P均<0.05)，PPG组Bax表达及AI均明显升高(P均<0.05)；各组间Bcl-2表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组肝细胞AI及肝组织Bax、Bcl-2阳性率比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与肝硬化组比较，#P<0.05。

3 讨论

腹腔注射NaHS可改变体内H2S含量。早期研究发现，H2S是一种存在于脑内的神经递质，对神经系统海马的长时程增强功能具有调节作用；随着研究的深入，人们陆续发现其对自发性高血压、阿尔茨海默病及肝硬化等疾病均具有调节作用。本课题组前期研究发现，H2S在肝硬化的发生、发展过程中及调节门静脉压力方面发挥重要的保护性作用[5～10]。有报道显示，H2S作为第三种气体信号分子与NO、CO气体信号分子存在相互作用[11]。

肝细胞凋亡是肝脏疾病最重要的发病原因之一，在正常肝脏发育及多种肝脏疾病的发生过程中具有重要作用[12，13]。肝脏在受到损伤因素，如病毒感染、酒精刺激等作用时，原本存在于体内的肝细胞死亡程序可能被激活，进而引起肝细胞的程序性死亡(凋亡)，并产生大量的凋亡小体。凋亡小体被肝脏中主要吞噬细胞-枯否细胞吞噬后产生大量的促炎症因子和凋亡受体，可进一步促进肝细胞的凋亡并能引发炎症反应；凋亡小体还可通过以下途径激活肝星状细胞：①直接刺激肝星状细胞的激活；②刺激枯否细胞活化而间接刺激肝星状细胞的活化；③刺激MMP-2/9活性而间接刺激肝星状细胞活化；活化后的肝星状细胞可产生大量的细胞外基质及胶原蛋白，最终导致肝纤维化的形成。因此认为，肝细胞病理性凋亡和肝纤维化发生密切相关，病理性肝细胞凋亡启动并促进了肝纤维化的发生。

Bcl-2家族是目前研究较多的凋亡相关基因，其家族成员包括两类：一类是凋亡促进基因，包括Bax、Bad、Bak等；另一类是以Bcl-2为代表的凋亡抑制基因。Bcl-2蛋白主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网膜及核膜等。Bax的表达更为广泛，可出现在肝细胞、血管平滑肌细胞等。研究发现，Bax与Bcl-2的比例(Bax/Bcl-2)关系是决定其对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。有研究表明，H2S可通过影响Bax的表达发挥其对心肌缺血再灌注损伤的保护性作用[14]；H2S在肝脏缺血再灌注损伤时通过抑制肝细胞凋亡发挥其保护性作用[15]。本研究结果显示，各组肝组织中均有Bax、Bcl-2表达，但Bax阳性率远高于Bcl-2，表明Bcl-2在肝脏中表达较少，甚至有研究认为其在肝组织中无表达。与肝硬化组比较，NaHS组Bax表达明显降低，PPG组Bax表达明显升高；各组间Bcl-2表达比较差异无统计学意义。此外，肝硬化组肝细胞凋亡增加，NaHS组肝细胞凋亡减少，PPG组肝细胞凋亡增加。与正常对照组比较，肝硬化组AI明显升高；与肝硬化组比较，NaHS组AI明显降低，PPG组AI明显升高；进一步证实了上述观点。

综上所述，NaHS在大鼠肝硬化的发生、发展过程中具有保护性作用，其作用机制可能为下调Bax表达。

[1] Melnik AV, Voloshchouk NI, Pentyuk NO. Role of hydrogen sulfide and sulfur-containing amino acids in regulation of tone of smooth muscles of the vascular wall in rats[J]. J Neurophysiol, 2010,42(2):104-109.

[2] Chuah SC, Moore PK, Zhu YZ. S-allylcysteine mediates cardioprotection in an acute myocardial infarction rat model via a hydrogen sulfide-mediated pathway[J]. Am Physiol Heart Circ Physiol, 2007,293(5):H2693-H2701.

[3] Sidhapuriwala JN, Ng SW, Bhatia M. Effects of hydrogen sulfide on inflammation in caerulein-induced acute pancreatitis[J]. J Inflamm (Lond), 2009(6):35.

[4] Hirata I, Naito Y, Takagi T, et al. Endogenous hydrogen sulfide is an anti-inflammatory molecule in dextran sodium sulfate-induced colitis in mice[J]. Dig Dis Sci, 2011,56(5):1379-1386.

[5] 张宁，郑勇，陈卫刚，等.内源性硫化氢在不同时期大鼠肝硬化中的作用[J].世界华人消化杂，2009，17(3)：307-311.

[6] 何春萍，田德安，王波，等.硫化氢供体对实验性门静脉高压及内源性一氧化氮/一氧化氮合酶体系的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志，2007，16(6)：572-575.

[7] 陈卫刚，郑勇，宋丽秀，等.内源性H2S对大鼠实验性肝硬化门脉高压的影响[J].世界华人消化杂志，2011，19(5)：467-471.

[8] 刘维国，郑勇，李文娟，等.硫化氢对大鼠实验性肝硬化门静脉压力的影响[J].山东医药，2010，50(24)：39-40.

[9] 陈卫刚，郑勇，张宁，等.硫化氢对肝硬化大鼠门静脉压力及肝细胞增殖的影响[J].山东医药，2013，53(6)：18-20.

[10] 张宁，郑勇，李睿，等.不同时期肝硬化大鼠门静脉血与下腔静脉血中内源性硫化氢的比较[J].石河子大学学报：自然科学版，2009，27(1)：51-54.

[11] 宋丽秀，郑勇，陈卫刚，等.大鼠肝硬化形成中气体信号分子一氧化氮、一氧化碳对硫化氢/胱硫醚-γ-裂解酶体系的影响[J].现代生物医学进展，2010，10(7)：1213-1216.

[12] Kilicarslan A, Kahraman A, Akkiz H, et al. Apoptosis in selected liver diseases[J]. Turk J Gastroenterol, 2009,20(3):171-179.

[13] Guicciardi ME, Gores GJ. Apoptosis as a mechanism for liver disease progresssion[J]. Semin Liver Dis, 2010,30(4):402-410.

[14] 黄晓伟，姚玲玲，朱依纯，等.外源性H2S在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用[J].复旦学报：医学版，2008，35(2)：216-219.

[15] 康凯，姜洪池，赵鸣雁，等.胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢系统在大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用[J].中华外科杂志，2010，48(12)：294-298.

国家自然科学基金资助项目(81170402)。