刘广宣，赵茜，隋月，关丁越，孙博，朱丹彤，齐先福

(辽宁省肿瘤医院，沈阳110042)

5-氟尿嘧啶与肠外营养液配伍制剂的体外稳定性和体内抗肿瘤活性

刘广宣，赵茜，隋月，关丁越，孙博，朱丹彤，齐先福

(辽宁省肿瘤医院，沈阳110042)

目的 观察5-氟尿嘧啶(5-Fu)与肠外营养液配伍制剂(简称5-Fu肠外营养液)的体外稳定性和体内抗肿瘤活性，为其临床应用提供依据。方法 配制空白肠外营养液及5-Fu肠外营养液，室温条件下观察配制24 h内两种营养液的外观、脂肪乳微粒的平均粒径及变异系数、pH值、渗透压，采用高效液相色谱分析法分析5-Fu肠外营养液中5-Fu含量的稳定性。将小鼠肝癌细胞H22瘤株接种于小鼠，制备移植性实体瘤模型。接种第3天将小鼠随机分为5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-TPN-H、5-FU-NS、TPN及对照组，每组10只。前三组分别腹腔注射含30、65、130 mg/kg 5-Fu的5-Fu肠外营养液，后三组分别腹腔注射含65 mg/kg 5-Fu的生理盐水注射液及等量的空白肠外营养液、生理盐水，均隔天给药1次，共给药5次。末次给药结束第2天处死小鼠，计算抑瘤率。结果 5-Fu肠外营养液与空白肠外营养液配制24 h内外观、脂肪乳微粒的平均粒径及变异系数、pH值、渗透压和含量均无明显变化(P均>0.05)。5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-NS、TPN组抑瘤率分别为24.3%、91.8%、78.7%、14.6%，5-FU-TPN-M、5-FU-NS组抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN组，且5-FU-TPN-M组高于5-FU-NS组，组间比较P均<0.01；5-FU-TPN-H组药物毒性较大，给药过程中死亡6只，未统计抑瘤率。结论 5-Fu肠外营养液配制24 h内性质稳定，抗肿瘤活性较单独给予5-Fu提高。

5-氟尿嘧啶；肠外营养液；配伍；抑瘤率；小鼠

研究显示，约52%的恶性肿瘤患者伴有中度或重度营养不良[1]，90%以上的患者需要改善营养状况。全胃肠外营养(TPN)是从静脉内供给患者营养物质，是手术前后及危重患者营养支持的主要手段。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是消化系统肿瘤的首选化疗药物之一，通过将细胞周期阻滞于G1/S期、干扰细胞基本生物合成、诱导细胞凋亡等发挥抑制肿瘤生长的作用。癌症患者尤其是晚期癌症患者常需要同时通过静脉输液给予化疗药物及肠外营养液，但二者是否可以配伍及配伍后的抗肿瘤效果报道较少。2015年12月～2016年3月，我们观察了5-Fu与肠外营养液配伍制剂(简称5-Fu肠外营养液)的体外稳定性和体内抗肿瘤活性，旨在为其临床应用提供依据。1 材料与方法

1.1 材料 ①仪器：9110高效液相色谱仪，TGL-16G台式高速离心机，CPA124S电子天平，PHS-25C精密酸度计，Nicomp 380粒度测定仪，L-119A试管恒温加热仪，L-128氮吹浓缩仪。②试剂：5-Fu复方氨基酸注射液(15-HBC)，脂肪乳注射液，N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液，注射用水溶性维生素，注射用脂溶性维生素(Ⅱ)，注射用脂溶性维生素(Ⅱ)专用溶媒，多种微量元素注射液(Ⅱ)，硫酸镁注射液，葡萄糖酸钙注射液，葡糖糖注射液，复合磷酸氢钾注射液，胰岛素注射液。③动物：昆明种小鼠60只，体质量18～22 g，雌雄不限，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK2015-0001。细胞株：小鼠肝癌H22细胞株为本实验室保存。

1.2 5-Fu肠外营养液制备 先制备空白肠外营养液：将生理盐水1 000 mL充入营养袋；将硫酸镁注射液、氯化钾注射液、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液、多种微量元素注射液(Ⅱ)、葡萄糖酸钙注射液依次加入复方氨基酸注射液中混匀，一并充入营养袋；将50%葡萄糖注射液、胰岛素注射液、复合磷酸氢钾注射液依次加入10%葡萄糖注射液中，混匀，一并充入营养袋；取注射用水溶解1支注射用脂溶性维生素(Ⅱ)，再将此溶液打入注射用水溶性维生素(1支)的安瓿中，最后抽取全部混合药液加入脂肪乳中，混匀，一并充入营养袋，再次混匀，即得空白营养液。按此法平行配制空白营养液6份。制备5-Fu肠外营养液：采用空白肠外营养液将规格为250 mg/10 mL的5-Fu注射液进行12.5倍稀释，得到含20 mg/mL 5-Fu的肠外营养液。按此法平行配制6份。

1.3 5-Fu肠外营养液相关指标观察

1.3.1 理化性质 室温条件下观察空白肠外营养液及5-Fu肠外营养液的外观；分别于配制0、2、4、6、8、10、12、16、24 h时对两种营养液采样，采用Nicomp 380粒度检测仪测定脂肪乳微粒的平均粒径(MD)及粒径变异系数(CV)，采用pH计测定pH值，采用渗透压测定仪测量渗透压。

1.3.2 5-Fu含量的稳定性及回收率 采用高效液相色谱分析法。色谱柱：Venusil ASB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水(磷酸调节pH为3.0)-甲醇(95∶5)；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。取5-Fu肠外营养液6份，分别进样并记录色谱图，计算5-Fu含量及相对标准偏差(RSD)；取5-Fu肠外营养液3份，分别精密加入120.00 μg/mL甲硝唑对照液1.8、2.2、2.6 mL，分别进样并记录色谱图，计算样品平均回收率。1.3.3 抗肿瘤作用 液氮中取出保种的小鼠肝癌H22细胞冻存管，迅速置于37 ℃温水中复苏。将复苏的H22细胞悬液接种于小鼠腹腔内，接种7天后无菌条件下抽取乳白色黏稠腹水，倒置显微镜下计数，肿瘤细胞活度>95%时调整瘤细胞密度为2.0×107个/mL。将肿瘤细胞混悬液接种于60只昆明种小鼠右前腋下皮下组织(0.2 mL/只)，建立肿瘤模型。于接种第3天将小鼠随机分为5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-TPN-H、5-FU-NS、TPN及对照组，每组10只，前三组分别腹腔注射含30、65、130 mg/kg 5-Fu的5-Fu肠外营养液，后三组分别腹腔注射含65 mg/kg 5-Fu的生理盐水注射液及等量的空白肠外营养液、生理盐水，均隔天给药1次，共给药5次。末次给药结束第2天处死小鼠，完整剥离皮下瘤结节，称取质量，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

2 结果

2.1 5-Fu肠外营养液的理化性质 配制24h内，5-Fu肠外营养液及空白肠外营养液外观均为乳白色液体，未见分层、浑浊和沉淀等变化。配制0、2、4、6、8、10、12、16、24h时两种液体脂肪乳微粒的MD、CV及pH值、渗透压均无明显变化(P均>0.05)，且CV均<0.5，pH值均为5.0～6.6，渗透压均<900mOsm/L。见表1。

表1 5-Fu肠外营养液及空白肠外营养液配制各时间点MD、CV、pH值及渗透压

2.2 5-Fu肠外营养液中5-Fu的稳定性及回收率 6份5-Fu肠外营养液中5-Fu含量分别为99.33%、100.80%、100.25%、100.34%、99.67%、98.91%，RSD为0.71%(<2%)，说明样品制备方法重复性好。3份5-Fu肠外营养液平均回收率分别为102.68%、99.45%、101.12%，回收率较好。

2.3 5-Fu肠外营养液的抗肿瘤作用 5-FU-TPN-L、5-FU-TPN-M、5-FU-NS、TPN组抑瘤率分别为24.3%、91.8%、78.7%、14.6%，5-FU-TPN-M、5-FU-NS组抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN组，且5-FU-TPN-M组高于5-FU-NS组，组间比较P均<0.01；5-FU-TPN-H组毒性较大，给药过程中死亡6只，未统计抑瘤率。见表2。

表2 各组肿瘤质量及抑瘤率

3 讨论

TPN是指由胃肠外途径(通常是静脉)供给机体足够的蛋白质(氨基酸)、脂肪、糖类、维生素、微量元素、电解质和水分等，因其所含组分较多，通常单独输注，理论上不宜与其他药物混合使用，但为方便临床和减少对患者的损伤，已有西咪替丁、法莫替丁和甲硝唑等药物与肠外营养液配伍的报道[2～6]。本研究结果显示，5-Fu肠外营养液配制24 h内其外观、脂肪乳粒径大小及分布、pH值、渗透压、含量均无显著性变化，与空白肠外营养液5-Fu肠外营养液各时间点上述指标差异均无统计学意义，提示5-Fu肠外营养液性质较稳定，5-Fu未对肠外营养液理化性质造成明显影响。

本研究选取小鼠肝癌H22细胞进行抑瘤效果观察，因H22细胞便于小鼠接种，易于造模，且H22对5-Fu相对敏感。结果显示， 5-FU-TPN-M、5-FU-NS组抑瘤率均高于5-FU-TPN-L、TPN组，且5-FU-TPN-M组高于5-FU-NS组，含65 mg/kg 5-Fu的5-Fu肠外营养液抑瘤率高于5-Fu单独给药组。上述结果产生原因可能为：①5-Fu主要针对增殖期肿瘤细胞，难以对休止期(G0期)肿瘤细胞产生杀伤作用，而化疗过程中大部分肿瘤细胞处于G0期(G0期细胞对潜在的致死损伤有较强的修复能力，往往是肿瘤复发和转移的根源)。有研究认为，营养支持能刺激肿瘤细胞的增殖和发展，促进G0期肿瘤细胞进入增殖期，从而提高化疗敏感性，达到提高化疗疗效的目的[7]。Wang等[8]建立了裸鼠食管癌模型，发现胰岛素与化疗药联用能达到增效、不增加毒性的目的。肠外营养液中所含胰岛素可能是5-Fu抗肿瘤活性增加的原因。②另有观点认为，肠外营养液通过提高机体免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡[9]。肠外营养液中含有的精氨酸组分具有组织特异性免疫刺激作用，药理剂量的精氨酸可明显改善机体的免疫功能，其作用机制主要为增加T淋巴细胞对刀豆素A(ConA)和植物血球凝集素(PHA)的反应性，增加CD4+细胞数量；提高外周血NK细胞数量、NK细胞活性及LAK细胞活性，促进IL-2产生，增加细胞毒性T细胞的功能，诱导IL-2R表达[10]。此外，谷氨酰胺亦是肠外营养液中的常见成分，在各种组织中其均为重要的氮源和能量来源，可直接供能于淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，通过促进淋巴细胞增殖、细胞因子产生及吞噬细胞等的杀伤作用而发挥免疫调节功能。谷氨酰胺能促进谷胱甘肽的合成，通过维持抗氧化系统功能而参与对机体的免疫保护[11,12]。③肠外营养液中含有铬、铜、铁、锰、钼、硒、锌等多种微量元素，其中锌可通过激活p53及caspase通路促进肿瘤细胞凋亡[13]；硒可调控肿瘤细胞信号转导途径，修饰p53的氨基酸残基位点；通过影响信号转导途径中的连接蛋白如丝裂原蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)，促进肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[14～16]。此外，药理学研究表明，金属离子与具有生物活性的有机配体结合后，通过配体与金属离子之间的协同作用使药效得到增强。5-Fu可能与铜、铁、锌等金属离子形成配合物，生成Cu(5-Fu)2Cl2、Cu(5-Fu)2(NO3)2、Zn(5-Fu)2Cl2和Fe(5-Fu)3SO4等配合物，进而增强其疗效[17,18]。

综上所述，5-Fu肠外营养液配伍24 h内性质稳定，且抗肿瘤活性增强，但具体作用机制有待进一步探讨。

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Stability in vitro and antitumor activity in vivo of preparations of 5-Fu mixed with parenteral nutrition solution

LIUGuangxuan,ZHAOQian,SUIYue,GUANDingyue,SUNBo,ZHUDantong,QIXianfu

(LiaoningCancerHospital,Shenyang110042,China)

Objective To observe the compatible stability in vitro and antitumor activity in vivo of preparations of 5-fluorouracil (5-Fu) mixed with total parenteral nutrition (TPN) solution (5-Fu and TPN solution) and to provide the basis for its clinical application. Methods The blank parenteral nutrition solution and 5-Fu and TPN solution were mixed at room temperature for 24 h. The appearances were observed and the mean diameter (MD) and coefficient of variation (CV) of fat particles, pH value and osmotic pressure was evaluated. The stability of 5-Fu in the 5-Fu and TPN solution was determined by HPLC. The H22 transplanted models of mice were established. Sixty mice were divided into six groups: 5-FU-TPN-L (30 mg/kg), 5-FU-TPN-M (65 mg/kg), 5-FU-TPN-H (130 mg/kg), 5-FU-NS (65 mg/kg), TPN and the control group, each group had 10 mice. On the day 3 after being inoculated with H22 tumor cells, the mice in the six groups were intraperitoneally injected with the above six kinds of liquids, separately, once every other day for 5 times. On day 2 after the last administration, mice were killed and antitumor rate was calculated. Results Compared with the blank parenteral nutrition solution, there were no significant changes in the appearances, MD, CV, pH value, osmotic pressure and the contents of 5-Fu within 24 h of 5-Fu and TPN solution (allP>0.05). The antitumor rates of the 5-FU-TPN-L, 5-FU-TPN-M, 5-FU-NS, and TPN groups were 24.3%, 91.8%, 78.7% and 14.6%, the antitumor rate of the 5-FU-TPN-M and 5-FU-NS groups were higher than those of the 5-FU-TPN-L and TPN groups, and the antitumor rate of 5-FU-TPN-M group was higher than that of the 5-FU-NS group, significant difference was found between every two groups (allP<0.01). The toxicity of 5-FU-TPN-H was strong, and 6 mice died, so no statistics were carried out. Conclusion 5-Fu in TPN solution is stable within 24 h and the antitumor effect of 5-Fu at 65 mg/mL is better than single administration of 5-Fu.

5-fluorouracil; parenteral nutrition solutions; compatibility; antitumor rate; mice

辽宁省自然科学基金资助项目(2103020186)。

刘广宣(1963-)，男，主任药师，研究方向为肿瘤药理学。E-mail: guangxuan2004@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.003

R979.1

A

1002-266X(2016)44-0008-04

2016-03-12)