孟昭杰， 巴雅尔， 张 明， 陈 立

(1中山大学材料科学与工程学院， 广东 广州 510275； 2深圳市海普瑞药业股份有限公司， 广东 深圳 518057；3吉林大学基础医学院药理系， 吉林 长春 130021； 4包头市肿瘤医院综合内科， 内蒙古 包头 014030)



黄连素通过调节miRNA-146a促进乳腺癌细胞凋亡*

孟昭杰1, 2, 3， 巴雅尔4， 张 明3△， 陈 立3

(1中山大学材料科学与工程学院， 广东 广州 510275；2深圳市海普瑞药业股份有限公司， 广东 深圳 518057；3吉林大学基础医学院药理系， 吉林 长春 130021；4包头市肿瘤医院综合内科， 内蒙古 包头 014030)

目的： 探讨黄连素对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：乳腺癌细胞MCF-7采用含10%小牛血清的1640培养基培养，实验分为对照组、黄连素低剂量组、黄连素中剂量组和黄连素高剂量组。给药处理24 h后，采用MTT法检测各组中MCF-7细胞的存活率；Hoechst 33258染色及流式细胞技术观察细胞的凋亡情况；采用Western blot法检测各组MCF-7细胞中NF-κB P65磷酸化水平及促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平；RT-qPCR法检测细胞中microRNA-146a(miRNA-146a)的水平。为进一步探讨黄连素影响乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用机制，本实验还检测了转染miRNA-146a siRNA后黄连素对促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA水平的影响。结果：MTT实验结果显示，与对照组相比，黄连素中、高剂量给药组MCF-7细胞的存活率明显降低，且呈一定的剂量依赖性(P<0.01)；Hoechst 33258染色观察到给药组细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染；流式细胞技术实验结果亦显示，黄连素给药组MCF-7细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；Western blot实验结果显示，与对照组比较，黄连素给药组的p-P65和Bcl-2表达水平明显降低，Bax表达水平明显升高，且呈一定的剂量依赖性(P<0.05)；RT-qPCR实验结果显示，与对照组比较，黄连素给药组的miRNA-146a表达水平明显升高，且呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。黄连素给药联合转染miRNA-146a siRNA后，与黄连素单独给药组相比，MCF-7细胞中Bax mRNA水平显著下降(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平显著上调(P<0.05)。结论：黄连素能够促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡，其机制可能有部分是通过miRNA-146a抑制NF-κB P65磷酸化，最终影响凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的表达。

黄连素； MicroRNA-146a； 乳腺癌； 细胞凋亡

乳腺癌已成为女性较为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发生发展日趋年轻化，发病率和死亡率也逐年增高，预计到2021年将会达到百分之一[1-2]。因此，研究和开发具有高效的抗乳腺癌的药物是我们亟待解决的问题。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类长约19～22个核苷酸的内源性的非编码小分子RNA，在细胞的生长、分化及凋亡等方面起到关键作用。近年来研究证实，miR-146a的表达与乳腺癌细胞的增殖、转移、凋亡等密切相关[3-4]。研究发现，在乳腺癌细胞MCF-7中过表达miR-146a可以抑制NF-κB信号通路，从而促进细胞凋亡，降低乳腺癌细胞的转移和侵袭能力[4]。

黄连素又名小檗碱(berberine,BBR)，是从我国传统中药黄连中提取的一种重要的生物碱，具有显著的抑菌、抗炎、降糖、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性。近来研究显示，黄连素能够提高乳腺癌细胞MCF-7的药物敏感性，抑制乳腺癌细胞的转移，促进乳腺癌细胞的凋亡[5]，亦有研究显示黄连素可抑制NF-κB的表达[6]，但其是否能以miR-146a为靶点促进乳腺癌细胞的凋亡还有待进一步研究。

材 料 和 方 法

1 细胞、试剂和仪器

MCF-7细胞系购自上海复旦细胞库。黄连素(东北制药厂)；RPMI-1640培养基、小牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco)；噻唑兰(MTT)(Sigma)；Annexin V-FITC流式检测试剂盒(上海生物科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；抗NF-κB(P65)、p-P65、Bax、Bcl-2、GAPDH Ⅰ抗及相应的Ⅱ抗(Abcam)；miRNA-146a siRNA(上海吉玛生物股份有限公司)；RT-qPCR试剂盒(TaKaRa)。低温超速离心机(Thermo)；Westen blot电泳系统(Bio-Rad)；凝胶成像系统(Tanon)；相差显微镜(Olympus)；分析天平(Mettler Toledo)；超净工作台(SIEMENS)；细胞培养箱、酶标仪(Sanyo)；流式细胞仪(Beckman)。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 MCF-7细胞采用含双抗(100 mg/L链霉素和1×105U/L 青霉素)的RPMI-1640培养基加10%小牛血清培养，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每2～3 d换液，待细胞生长至对数生长期后进行实验，实验分为4组，分别为对照组(control组)、黄连素低剂量(low dose,L;2.5 μmol/L)组(BBR-L组)、黄连素中剂量(medium dose,M;5 μmol/L)组(BBR-M组)和黄连素高剂量(high dose,H;10 μmol/L)组(BBR-H组)，给药处理24 h后收集细胞。

2.2 MTT实验检测细胞活力 将MCF-7细胞接种于96孔板中，每孔5×103个，细胞贴壁后给予黄连素处理24 h，每孔加入5 g/L MTT溶液，置于细胞培养箱中继续孵育2～4 h。孵育结束后弃去上清，每孔加入150 μL DMSO,置于酶标仪(490 nm)读取吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

2.3 Hoechst 33258染色 将MCF-7细胞接种于铺有盖玻片的6孔板中，每孔2×105个，细胞贴壁后给予黄连素处理24 h， PBS洗涤细胞 1 min、3次，每孔加入中性多聚甲醛，室温下固定15 min， PBS洗涤1 min、3次，之后加入500 μL Hoechst 33258染色液(5 mg/L)避光染色10 min，PBS洗涤1 min、3次，之后取出盖玻片倒扣于滴加了抗荧光淬灭剂的载玻片上，封片，荧光显微镜下观察。

2.4 流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡情况 MCF-7细胞培养24 h后，换含不同剂量黄连素的血清及对照血清继续培养24 h，胰酶消化，收集培养液；1 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清；加入1 mL PBS重悬细胞，轻轻振荡使细胞悬浮，300目尼龙网过滤细胞；离心，弃上清；按Annexin V细胞凋亡试剂盒步骤操作，同时以不加Annexin V-FITC及PI的MCF-7细胞作为阴性对照。

2.5 Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达 提取细胞总蛋白，用BCA蛋白浓度试剂盒测定样品蛋白含量，配制5%浓缩胶和15%分离胶，上样，电泳，之后将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，并于5%脱脂奶粉或5% 牛血清白蛋白封闭液中室温下封闭2 h，洗膜，加 I 抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、p-P65(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)，室温孵育2 h，洗膜，加Ⅱ抗(1∶10 000)室温孵育2 h，洗膜，采用ECL化学发光法显色，使用Quantity One软件对结果进行处理分析。

2.6 mRNA水平检测 不同剂量黄连素对MCF-7细胞miR-146a影响的检测：MCF-7细胞使用不同剂量BBR处理24 h后提取RNA;转染miR-146a siRNA后相关mRNA检测：细胞以每孔2×104个接种于24孔板，转染6 h后去除转染试剂，给予5 μmol/L黄连素处理24 h，采用TRIzol法抽提MCF-7细胞总RNA,并按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。miR-146a的上游引物为5’-CCGATGTGTATCCTCAGC-TTTG-3’,下游引物为5’-GCTGAAGAACTGAATTT-CAGAGGTC-3’;U6的上游引物为5’-CTCGCTTCGGC-AGCACATA-3’,下游引物为5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’;Bcl-2的上游引物为5’-GGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGA-3’，下游引物为5’-TGCACA-GCGGGCATTGGGTT-3’;Bax的上游引物为5’-CA-GGGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3’,下游引物为5’-CGGGGGGAGTCCGTGTCCACGTCAG-3’。扩增条件为：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,40个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s。检测结果以2-ΔΔCt法计算，并将对照组的表达水平归化为1后计算相对表达水平。

2.7 miR-146a siRNA转染效率检测 将对数期的MCF-7细胞接种于6孔板中，采用无双抗培养基培养。24 h后按照Lipo2000转染说明，采用瞬时转染法将1 μg miR-146a siRNA和阴性对照siRNA转染至乳腺癌细胞MCF-7中，转染6 h后去除转染试剂，荧光显微镜下观察转染效率。

3 统计学处理

使用SPSS 17.0软件进行数据统计。计量资料均以均数±标准误(mean±SEM)表示，多组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 黄连素对MCF-7细胞存活率的影响

MTT实验结果如图1所示，BBR-L组的细胞存活率与control组比较未有显著性差异，而BBR-M和BBR-H组的细胞存活率与control组相比则显著降低(P<0.01)。

2 黄连素对MCF-7细胞细胞核的影响

Hoechst 33258染色实验结果可见，control组细胞的细胞核边缘光滑整齐，呈蓝色，均匀淡染；BBR给药组细胞的细胞核固缩，边缘不整齐，呈碎块状致密浓染，甚至可见裂解的细胞核；随给药浓度的增大，细胞核改变更为明显，见图2。

Figure 1.The viability of the MCF-7 cells in each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol.

图1 黄连素对MCF-7细胞存活率的影响

Figure 2.The effect of berberine on the morphological changes of the nucleus in the MCF-7 cells (×400).

图2 黄连素对MCF-7细胞细胞核形态的影响

3 黄连素对MCF-7细胞凋亡的影响

采用流式细胞技术检测结果显示， BBR-L组的细胞凋亡率为(9.15±1.31)%，与control组比较无显著性差异；BBR-M和BBR-H组细胞凋亡率分别为(15.77±1.20)%和(22.37±0.89)%，与对照组相比均显著升高(P<0.05),见图3。

4 黄连素对MCF-7相关蛋白表达的影响

与control组相比，黄连素给药组p-P65和Bcl-2表达水平降低，且呈一定的剂量依赖性。BBR-M和BBR-H组p-P65的表达与control组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与control组相比，黄连素给药后促凋亡蛋白Bax蛋白表达水平升高，且呈一定的剂量依赖性。BBR-M和BBR-H组Bax蛋白表达水平与control组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

Figure 3.The effect of berberine on apoptosis in the MCF-7 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

图3 黄连素对MCF-7细胞凋亡的影响

5 黄连素对MCF-7细胞miR-146a表达水平的影响

与control组相比，黄连素给药后miRNA-146a的表达水平升高，呈一定的剂量依赖性。BBR-M组和BBR-H组的miRNA-146a表达水平与control组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

6 MCF-7细胞中miR-146a siRNA转染效率的检测

采用瞬时转染法转染miR-146a siRNA于MCF-7细胞24 h后在荧光显微镜下观察miR-146a siRNA的转染效率，约有60%以上的细胞表达绿色荧光蛋白。与此同时，RT-qPCR实验结果也显示转染miR-146a siRNA 24 h后，MCF-7细胞中miR-146a的表达明显降低，说明可用于后续实验,见图6。

7 黄连素通过miR-146a调控对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的mRNA水平的影响

与control组相比，转染miRNA-146a siRNA后24 h，MCF-7细胞中促凋亡蛋白Bax的mRNA表达水平明显降低，抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表达水平明显升高；与BBR组相比，miRNA-146a siRNA与黄连素联合应用后，大大削弱了黄连素促进MCF-7细胞凋亡的效应，Bax的mRNA表达水平明显降低，抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表达水平明显升高。说明黄连素能够促进乳腺癌细胞MCF-7的凋亡，至少部分是通过miRNA-146a实现的，见图7。

Figure 4.The effect of berberine on the protein expression of Bax, Bcl-2 and p-P65 in the MCF-7 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图4 黄连素对MCF-7细胞Bax、Bcl-2和p-P65蛋白表达的影响

Figure 5.The effect of berberine on the expression of miRNA-146a in the MCF-7 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图5 黄连素对MCF-7细胞miRNA-146a表达的影响

讨 论

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤，是全世界排名第二的肿瘤疾病，每年有近50万女性患者死于乳腺癌[7]。诸多因素参与了乳腺癌的形成、发展及转移，microRNA 是其重要的影响因素之一，并且可能用于乳腺癌的早期诊断[8]。miR-155和miR-21是具有促癌作用的microRNA。Zhang 等[9]证实，miR-155可直接与肿瘤蛋白53诱导核蛋白1(Tp53INP1，一种抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的蛋白)3’-UTR区结合，使Tp53INP1表达减少，从而抑制癌细胞分化周期G1期的停滞，促进癌细胞增殖。

Figure 6.The efficiency of miR-146a siRNA transfection detected by RT-qPCR. siRNA: miR-146 siRNA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group.

图6 MCF-7细胞中miR-146a siRNA转染效率的检测

Figure 7.The effect of berberine and know-down of miR-146a on the mRNA expression of Bax and Bcl-2. siRNA: miR-146a siRNA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsBBR group.

图7 黄连素通过miR-146a调节凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 mRNA的表达水平

Li 等[10]发现，转移率高的乳腺癌中miR-21 的表达明显高于转移率低的乳腺癌。近年来研究证实，miRNA-146a是一个典型的多功能microRNA，参与炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生发展。Kumar等[11]证实，与健康志愿者相比，乳腺癌患者血清中miR-146a水平显著升高，这一点可以用作乳腺癌的诊断指标。但乳腺癌患者血清中高水平的miR-146a是如何产生并进一步影响乳腺癌病程的发生和发展目前尚没有报道。另有大量研究报道，NF-κB是miR-146a的靶蛋白[12]，miR-146a通过调节NF-κB的表达对炎症、免疫疾病、糖脂代谢异常及肿瘤等疾病进行调节。

近年来，黄连素作为传统的治疗腹泻药物，被广泛地证明具有抗炎、降糖、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性。黄连素抑制乳腺癌增殖作用亦被广泛报道。Li等[13]研究表明，黄连素可以下调乳腺癌MDA-MA-231细胞中NF-κB的表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖；Pazhang等[6]证实，黄连素可以通过调节NF-κB的表达，进而影响环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表达，达到促进人乳腺导管上皮肿瘤细胞凋亡的作用。然而，黄连素在乳腺癌细胞中是否对miR-146a具有调节作用，以及更进一步通过miR-146a调节NF-κB诱导乳腺癌细胞凋亡目前尚无报道。本实验结果显示黄连素处理细胞后，MCF-7细胞凋亡率显著增加，Bax表达明显升高、Bcl-2表达水平明显降低，呈剂量依赖性，且p-P65的表达水平随黄连素浓度的增加而降低，miRNA-146a表达水平明显增加。本实验研究也显示将miRNA-146a 沉默后，黄连素促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡的水平明显降低。说明黄连素能够促进乳腺癌细胞的凋亡至少部分是通过miR-146a实现的。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Berberine promotes apoptosis of human breast cancer cells by regulating miRNA-146a

MENG Zhao-jie1, 2, 3, BA Ya-er4, ZHANG Ming3, CHEN Li3

(1SchoolofMaterialsScienceandEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China;2ShenzhenHepalinkPharmaceuticalCo.,Ltd,Shenzhen518057,China;3DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China;4ComprehensiveMedicineDepartment,BaotouCancerHospital,Baotou014030,China.E-mail:zhangming_00@126.com)

AIM: To observe the effect of berberine on apoptosis of MCF-7 cells and its potential mechanism. METHODS: The MCF-7 cells were divided into control group and the groups with 3 different doses of berberine. The cell viability was detected by MTT assay, while the cell apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining and flow cytometry assay. The protein levels of p-P65, Bax and Bcl-2 were Western blot. The levels of microRNA-146a(miRNA-146a) in the MCF-7 cells were detected by RT-qPCR. The miRNA-146a siRNA was transfected to the MCF-7 cells after an evaluation of transfection efficacy, which was co-incubated with berberine to observe its effects on the mRNA levels of Bax and Bcl-2. RESULTS: Compared with control group, the cell viabilities were decreased significantly in medium and high doses of berberine treatment groups with a dose-dependent manner (P<0.01). The cell apoptosis was increased significantly in medium and high doses of berberine treatment groups dose-dependently (P<0.05). The protein levels of Bax were up-regulated, while those of Bcl-2 and p-P65 were down-regulated significantly by the treatment of berberine (P<0.05). In addition, the miRNA-146a levels were increased significantly in medium and high doses of berberine treatment groups (P<0.05) and showed a dose-dependent manner. The mRNA levels of Bax were decreased, while the mRNA levels of Bcl-2 were increased after transfection with miRNA-146a siRNA and co-incubated with berberine. CONCLUSION: Berberine promotes apoptosis of MCF-7 cells. The mechanism may be related to inhibit the activity of NF-κB by incresing the levels of miRNA-146a.

Berberine; MicroRNA-146a; Breast cancer; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 1966- 06

2016- 09- 09

2016- 10- 13

吉林省科委基金(No. 20140203011YY; No. 20150311013YY)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.008

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△通讯作者 Tel: 0431-85619799; E-mail: zhangming_00@126.com