宋 嘉， 王 剑， 李 玉， 胡慧珍， 严 杰， 吴丽君， 徐 炜， 陈清勇

(中国人民解放军第一一七医院， 浙江 杭州 310013)



姜黄素抑制HGF诱导血管内皮细胞迁移和VEGF表达的体内外研究*

宋 嘉▲， 王 剑▲， 李 玉， 胡慧珍， 严 杰， 吴丽君， 徐 炜， 陈清勇△

(中国人民解放军第一一七医院， 浙江 杭州 310013)

目的： 探索姜黄素抑制肝细胞生长因子(HGF)诱导血管生成的分子机制。方法:利用管腔形成实验、划痕实验、Western blot实验和动物实验观察姜黄素、c-Met抑制剂SU11274、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002和mTOR抑制剂rapamycin对HGF诱导的内皮细胞迁移、管腔形成能力、血管内皮生长因子(VEGF)表达、相关信号通路和瘤体内血管密度的影响。结果:姜黄素可显著抑制HGF诱导内皮细胞发生迁移、小管形成及VEGF的表达，同时抑制c-Met/AKT/mTOR/S6通路的磷酸化，并可减少瘤体内VEGF的表达和微血管密度。使用c-Met抑制剂SU11274、PI3K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂rapamycin能得到和姜黄素相似的效应。结论:姜黄素抑制HGF诱导的血管生成可能是通过抑制c-Met/AKT/mTOR/S6信号通路活化实现的。

姜黄素； 肝细胞生长因子； 血管内皮生长因子； 血管生成

血管生成是肿瘤生长和转移的重要因素[1]，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)具有强烈的致肿瘤血管生成作用[2-3]。目前的研究均认为血管生成是肿瘤生长和转移的重要途径之一，血管网在肿瘤内增殖为肿瘤提供营养物质及氧气，保证肿瘤生长，同时在肿瘤释放的各种生长因子作用下，血管新生，进一步促进了肿瘤增殖及浸润。尽管抗肿瘤药物能有效杀灭肿瘤细胞，但由于周围血管支持，残存肿瘤细胞仍可继续存活，导致肿瘤复发。此外，由于肿瘤血管结构的特殊性，使得药物在向肿瘤内部输送时递减，也是导致抗肿瘤失败的原因之一。因此，抗血管生成在肿瘤治疗方面显得尤为重要。姜黄素(curcumin, CUR)有广泛的药理作用，如抗炎、抗肿瘤、调节免疫等[4]。而当前关于姜黄素能否抑制HGF诱导的血管生成及相关分子机制尚无研究报道，本实验将对姜黄素能否抑制HGF诱导的血管生成进行研究。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞 人非小细胞肺癌细胞A549购自上海中科院细胞库；人脐静脉内皮细胞(HUVECs)由浙江中医药大学提供。

1.2 主要试剂 姜黄素购自Sigma；HGF 购自Peprotech；c-Met抑制剂SU11274、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抑制剂LY294002和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制剂rapamycin购自Selleck Chemicals；抗p-Met(Y1234/35)、c-Met、p-Akt (S473)、p-mTOR (S2448)、AKT、mTOR、S6、p-S6、CD34、VEGF、GAPDH等抗体购自Cell Signaling Technology；羊抗兔IgG II抗购自Jackson。

1.3 实验动物 12只雄性BALB/c小鼠，4～6周龄，购自上海实验动物中心，饲养于浙江中医药大学动物房。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞用含10%胎牛血清和青霉素、链霉素(终浓度为1×105U/L)的RPMI-1640(Gibco)培养液，常规置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞实验。

2.2 细胞分组 实验分为对照(control)组、HGF组、HGF+SU11274组、HGF+LY294002组、HGF+rapamycin组、HGF+低、中、高浓度CUR组。其中HGF使用浓度为40 μg/L，SU11274使用浓度为5 μmol/L，LY294002使用浓度为20 μmol/L，rapamycin使用浓度为200 nmol/L，姜黄素低、中、高浓度分别为10、20、30 μmol/L。

2.3 划痕修复实验 接种3×105个HUVECs于6孔板，待细胞融合度为80%时，在板内进行划痕、拍照。吸去培养基，加入含有2.5%血清培养基，或含有高、中、低浓度姜黄素及SU11274、LY294002和rapamycin的培养基，作用2 h后加入HGF，使终浓度为40 ng/L，继续培养24 h。划痕修复率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

2.4 管腔形成实验 将1×104个(200 μL) HUVECs接种于预先铺有Matrigel的96孔板内，并加入上述浓度药物，培养6 h后用吖啶橙染色，PBS清洗3遍后在荧光倒置显微镜下拍照，并计算小管数量。

2.5 Western blot实验 用RAPI 裂解液提取各组细胞总蛋白并进行蛋白定量，每个泳道上蛋白样品10 μg，8% SDS-PAGE分离后，转印(300 mA，120 min)到PVDF膜上。5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白室温封闭1 h。分别加入对应 I 抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入 II 抗孵育2 h后洗膜，加入电化学发光法发光液，凝胶成像系统拍照，分析条带灰度值。

2.6 动物实验 实验方法、药物剂量参考前期的一些研究报道[5-7]。将1×107个(100 μL) A549细胞注射于小鼠的右侧前肢，在接种15 d后，将小鼠分为4组，每组3只，实验分别为对照(control)组、HGF组、HGF联合低浓度(100 mg/kg)CUR组，HGF联合高浓度(300 mg/kg)CUR组。每只小鼠灌胃30 μL DMSO或姜黄素，同时每隔3 d瘤内注射浓度为30 μg/kg的HGF或同体积的PBS。30 d后处死小鼠，瘤体固定包埋、切片，行免疫组化染色后，观察VEGF和CD34的表达量，计算微血管密度。

2.7 免疫组化染色及结果判定 切片常规脱蜡水化，56 ℃孵育2 h，浸泡在枸橼酸盐缓冲液中微波加热修复抗原，3% H2O2/甲醇封闭内源性过氧化物酶10 min，羊血清中孵育封闭20 min；滴加 I 抗，4 ℃孵育过夜，滴加 II 抗室温孵育30 min，滴加SABC液，室温孵育30 min。PBS漂洗后滴加DAB显色液，显色5～10 min；苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。VEGF和CD34以棕黄色颗粒为阳性，按细胞膜染色强度分为0(无色)、1(淡黄色)、2(中等黄色)、3(棕黄色)。每个样本中选取2个视野计数胞质被标记的细胞百分数。结果分为2组，其中无任何标记、染色强度为1分的细胞比例小于25%、染色强度为2分的细胞比例小于5%被认为是阴性结果，其余则认为是阳性的结果。

3 统计学处理

以上实验均至少重复3次，应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多个样本均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 姜黄素对HUVECs细胞形态的影响

显微镜下观察发现，HGF作用24 h后，内皮细胞的细胞形态为长梭形，而随着姜黄素浓度增加，细胞形态逐渐变为卵圆形，见图1。

2 姜黄素抑制HGF诱导内皮细胞发生迁移

与对照组相比，HGF可以显著诱导内皮细胞发生迁移(P<0．05)；与HGF组相比，姜黄素可抑制迁移的发生(P<0．05)，见图2。

Figure 1.The effect of curcumin on HGF-induced endothelial cell morphology (×200).

图1 姜黄素对HGF诱导的内皮细胞形态的影响

Figure 2.The effect of curcumin on HGF-induced endothelial cell migration ability (×100). Mean±SD.n=4.*P<0．05vscontrol group;#P<0．05,##P<0．01vsHGF group.

图2 姜黄素对HGF诱导的内皮细胞迁移能力的影响

3 姜黄素抑制HGF诱导HUVECs管腔形成

与对照组相比，HGF可以显著诱导内皮细胞小管形成(P<0．01)；与HGF组相比，姜黄素可显著抑制HGF诱导的小管形成(P<0．01)，见图3。

4 姜黄素抑制HGF诱导的VEGF表达

与对照组相比，HGF可诱导内皮细胞VEGF表达(P<0．01)，姜黄素可呈浓度依赖性抑制HGF诱导的VEGF表达(P<0．01)，见图4。

5 姜黄素抑制HGF诱导的c-Met/AKT/mTOR/S6通路相关分子的磷酸化

与对照组相比，HGF可诱导内皮细胞c-Met、AKT、mTOR和S6的磷酸化(P<0．05)，而姜黄素可呈浓度依赖性地抑制HGF诱导的c-Met、AKT、mTOR和S6的磷酸化(P<0．05)，见图5。

Figure 3.The effect curcumin on HGF-induced tubule formation of endothelial cells (×100). Mean±SD.n=4.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsHGF group.

图3 姜黄素对HGF诱导的内皮细胞管腔形成能力的影响

Figure 4.Curcumin inhibited VEGF expression induced by HGF. Mean±SD.n=4.**P<0．01vscontrol group;##P<0．01vsHGF group.

图4 姜黄素抑制HGF诱导的VEGF表达

6 SU11274、LY294002和rapamycin对HUVECs细胞形态的影响

光镜观察发现，HGF刺激HUVECs后，细胞形态变成长梭形，加入SU11274、LY294002和rapamycin后，细胞则呈卵圆形，见图6。

7 SU11274、LY294002和rapamycin抑制HGF诱导HUVECs细胞迁移

HGF可诱导HUVECs细胞发生迁移，与control组比较，差异有统计学显著性(P<0．05)。加入SU11274、LY294002和rapamycin可显著抑制HGF诱导的HUVECs发生迁移(P<0．01)，见图7。

8 SU11274、LY294002和rapamycin抑制HGF诱导的HUVECs管腔形成

HGF可诱导HUVECs细胞小管形成，与control组比较差异有统计学显著性(P<0．05)。加入SU11274、LY294002和rapamycin可显著抑制HGF诱导的HUVECs小管的形成(P<0．01)，见图8。

9 SU11274、LY294002、rapamycin抑制HGF诱导的VEGF表达

与对照组相比，HGF可诱导内皮细胞VEGF表达(P<0.01)；与HGF组相比，SU11274、LY294002和rapamycin可抑制HGF诱导的VEGF表达(P<0.05)，见图9。

Figure 5.Curcumin inhibited the phosphorylation of c-Met/Akt/mTOR/S6 pathway related molecules induced by HGF. Mean±SD.n=4.*P<0．05,**P<0．01vscontrol group;#P<0．05,##P<0．01vsHGF group.

图5 姜黄素抑制HGF诱导的c-met/AKT/mTOR/S6通路相关分子的磷酸化

Figure 6.The effect of SU11274 (SU), LY294002 (LY) and rapamycin (RA) on HGF-induced changes of endothelial cell morpho-logy (×200).

图6 SU11274、LY294002和rapamycin对HGF诱导的内皮细胞形态的影响

10 SU11274、LY294002和rapamycin抑制HGF诱导的c-Met、AKT、mTOR和S6的磷酸化

与对照组相比，HGF可诱导内皮细胞c-Met/AKT/mTOR/S6的磷酸化(P<0.05)；与HGF组相比，SU11274、LY294002和rapamycin可抑制HGF诱导的c-Met、AKT、mTOR和S6的磷酸化(P<0.05)，见图10。

11 姜黄素阻断HGF诱导小鼠肺癌模型瘤体内的血管生成

与对照组相比，瘤内注射HGF可显著增加组织VEGF的表达(P<0.01)及微血管数量(P<0.01)，而灌服姜黄素可以减少瘤体内VEGF的表达(P<0.01)及微血管数量(P<0.01)，见图11。

讨 论

血管生成是肿瘤生长和转移的重要途径之一，抗血管生成已成为肿瘤治疗的重要方向[8]。VEGF/VEGFR通路是介导血管内皮细胞增殖、分裂和迁移的最重要分子信号，抑制该信号可导致内皮细胞凋亡、抑制其迁移，减少肿瘤中血管形成、抑制血管渗透[9]。HGF是c-Met配体，可通过激活c-Met及其下游信号通路诱导细胞发生多种生物学行为，例如增殖、分化、侵袭、迁移等。多项研究表明，HGF/c-Met与血管生成存在密切相关性。刘滨等[10]发现，HGF、c-Met及VEGF的表达与星形细胞瘤恶性程度及肿瘤血管生长呈正相关。Hung等[11]研究发现HGF能诱导内皮细胞的VEGF表达，蛇床子素可通过抑制HGF/c-Met/AKT/mTOR通路抑制VEGF表达。Chen等[12]研究发现miR-206也可通过HGF/c-Met/AKT/mTOR途径抑制内皮细胞管腔形成。这些研究表明HGF/c-Met/AKT/mTOR在血管形成过程中扮演重要角色，抑制该靶点可能成为抗血管生成的有效机制。

Figure 7.The effect of HGF, SU11274 (SU), LY294002 (LY) and rapamycin (RA) on the endothelial cell migration ability (×100). Mean±SD.n=4.*P<0．05vscontrol group;##P<0．01vsHGF group.

图7 SU11274、LY294002和rapamycin对HGF诱导的内皮细胞迁移能力的影响

Figure 8.The effect of SU11274 (SU), LY294002 (LY) and rapamycin (RA) on HGF-induced tubule formation of the endothelial cells (×100). Mean±SD.n=4.*P<0．05vscontrol group;##P<0．01vsHGF group.

图8 SU11274、LY294002和rapamycin对HGF诱导的内皮细胞管腔形成能力的影响

Figure 9.SU11274 (SU), LY294002 (LY) and rapamycin (RA) inhibited VEGF expression induced by HGF. Mean±SD.n=4.**P<0．01vscontrol group;#P<0．05,##P<0．01vsHGF group.

图9 SU11274、LY294002和rapamycin抑制HGF诱导的VEGF表达

Figure 10.SU11274 (SU), LY294002 (LY) and rapamycin (RA) inhibited the phosphorylation of c-Met/AKT/mTOR/S6 pathway related molecules induced by HGF. Mean±SD.n=4.**P<0．01vscontrol group;#P<0．05,##P<0．01vsHGF group.

图10 SU11274、LY294002和rapamycin抑制HGF诱导的c-Met/AKT/mTOR/S6通路相关分子的磷酸化

Figure 11.Curcumin inhibited HGF induced VEGF expression and angiogenesis in the tumors (×40). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0．01vsHGF group.

图11 姜黄素抑制HGF诱导瘤体内VEGF表达及血管生成

以往的研究已证实姜黄素具有多种抗血管生成机制。Fu等[13]研究发现，姜黄素能够抑制内皮细胞增殖、迁移及VEGF表达，同时也能抑制小鼠肝癌模型内的血管生成。Dai等[14]研究发现姜黄素可抑制低氧条件下诱导的动物肝癌模型中的血管生成。而Bimonte等[15]研究发现，姜黄素能够通过抑制NF-κB途径来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移，并阻断其小鼠模型中的血管生成。但关于姜黄素能否通过HGF/c-Met/AKT/mTOR途径在体内外抑制血管生成的研究尚无报道。

本研究结果表明，HGF可有效诱导内皮细胞发生迁移及管腔形成，同时还可提高VEGF表达，姜黄素可抑制HGF诱导内皮细胞迁移、管腔形成及VEGF表达。使用c-Met抑制剂作为对照研究后发现，抑制c-Met磷酸化可抑制内皮细胞迁移、管腔形成及VEGF表达，并且使用c-Met下游PI3K、mTOR抑制剂阻断HGF激活AKT/mTOR磷酸化后，同样可取得上述效应，表明c-Met/AKT/mTOR通路在血管生成中发挥重要作用。而Western blot实验结果表明姜黄素也可抑制HGF诱导的内皮细胞c-Met及其下游AKT/mTOR的磷酸化，从而在体外实验中证实姜黄素抑制血管生成可能是通过抑制c-Met/AKT/mTOR磷酸化进而抑制VEGF表达来实现的。为进一步验证姜黄素在体内抗血管生成中的作用，我们通过在瘤体内注射HGF，同时灌胃姜黄素的方法研究姜黄素对肿瘤血管生成的确切作用，发现HGF可显著诱导瘤体内的血管生长，增加微血管密度，提高VEGF蛋白表达，而通过灌服姜黄素可显著减少瘤体内的血管数量及VEGF表达，证实灌服姜黄素抑制HGF诱导瘤体的血管生成的效果是显著的。

综上所述，本研究通过体内外实验研究发现，姜黄素抑制HGF诱导的血管生成的分子机制可能是通过抑制c-Met/AKT/mTOR/S6信号通路活化进而抑制VEGF蛋白表达实现的，这为姜黄素抗血管生成提供了新的理论依据。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Curcumin inhibits HGF induced vascular endothelial cell migration and VEGF expression in vitro and in vivo

SONG Jia, WANG Jian, LI Yu, HU Hui-zhen, YAN Jie, WU Li-jun, XU Wei, CHEN Qing-yong

(The117thHospitalofPLA,Hangzhou310013,China.E-mail:CQYong117@163.com)

AIM: To explore the molecular mechanism that curcumin inhibits hepatocyte growth factor (HGF) induced angiogenesis. METHODS: The effects of curcumin, c-Met inhibitor SU11274, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor LY294002 and mTOR inhibitor rapamycin on HGF-induced endothelial cell migration, tubule formation ability, vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, related signaling pathways and the density of blood vessels in tumors were observed by the methods of capillary forming experiments, wound healing assay, Western blot and animal study. RESULTS: SU11274, LY294002, rapamycin and curcumin significantly inhibited HGF induced endothelial cell migration, tubule formation and VEGF expression, suppressed the phosphorylation of c-Met/AKT/mTOR/S6 pathway related molecules, reduced VEGF expression and microvascular density in the tumors. CONCLUSION: Curcumin inhibits HGF induced angiogenesis by inhibiting c-Met/AKT/mTOR/S6 pathway activation.

Curcumin; Hepatocyte growth factor; Vascular endothelial growth factor; Angiogenesis

1000- 4718(2016)11- 1949- 09

2016- 03- 28

2016- 08- 09

南京军区医学科技创新项目(No.14ZD44； No.15MS158)；浙江省科技厅公益性技术应用研究计划(No.2014C33277)；杭州市科技发展计划项目(No.20130633B29； No.20140633B40)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.006

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0571-28084876； E-mail： CQYong117@163.com

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