侯鹏超 洪郁芝 叶迅

雷公藤内酯醇和缬沙坦对高糖诱导小鼠足细胞活性的影响

侯鹏超 洪郁芝 叶迅

目的 观察不同浓度高糖对小鼠足细胞活性的抑制作用，以及不同浓度雷公藤内酯醇（TP）和缬沙坦（Val）对高糖抑制后小鼠足细胞活性的影响，探讨高糖对足细胞的损伤作用，以及有效的药物干预浓度范围。方法 将培养成熟的小鼠足细胞随机分为对照组（11.1mmol/L葡萄糖）和不同浓度高糖组（16.1、21.1、26.1、31.1、36.1mmol/L），以上述浓度培养48h后采用CCK-8检测足细胞活性的变化。取活性变化最大的浓度为高糖诱导浓度，在此基础上随机分为不同浓度的TP组（4、8、16、32、64ng/ml）和Val组（2×10-8、2×10-7、2×10-6、2×10-5、2×10-4mol/L），以上述浓度干预48h后，采用CCK-8检测足细胞活性的变化。结果 （1）与对照组相比，除16.1mmol/L高糖组外，其余各高糖组的足细胞活性显著减少，其中以26.1mmol/L葡萄糖组减少最为明显（P＜0.01）。（2）与26.1mmol/L葡萄糖组相比，TP组（除4ng/ml组外）和Val组（除2×10-8mol/L组外）足细胞活性部分恢复，其中以16ng/ml TP组和2×10-5mol/L Val组足细胞活性恢复最为明显（P＜0.01）。结论 一定浓度范围的TP和Val可部分恢复受高糖抑制的小鼠足细胞活性。

高糖 雷公藤内酯醇 缬沙坦 足细胞 活性干预 CCK-8

糖尿病肾病（DN）是糖尿病重要的微血管并发症之一，蛋白尿是DN的主要临床表现和独立进展因素，因此蛋白尿的发病机制一直是DN研究的重点和热点。近年来肾小球滤过膜最外层足细胞逐渐引起了国内外学者的关注。足细胞转分化（EMT）是指足细胞在高糖等有害刺激诱导下，可由上皮细胞向间充质细胞转分化[1-2]，从而改变形态、活性和功能。目前观点认为足细胞EMT是导致DN蛋白尿的一个重要原因，而雷公藤内酯醇（TP）和缬沙坦（Val）可能具有抑制足细胞EMT，从而减轻蛋白尿的作用[3-4]。本研究探讨TP和Val两种药物对高糖诱导下小鼠足细胞活性的影响，并试图寻求药物的最佳干预浓度，为后续进行机制研究打下基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 小鼠足细胞由英国伦敦大学国王学院Guy’s医院赠送；Val原粉（2g/瓶）由瑞士诺华公司惠赠，TP原粉购自南京泽朗生物技术有限公司（10g/瓶，批号：ZL111012R）。RPMI 1640双抗培养基，FBS购自美国Gibco公司，使用时分别配置成含10%FBS的生长培养基，不含FBS的同步化培养基及含2.5%FBS的实验培养基；葡萄糖购自日本大冢制药公司；CCK-8购自东仁化学科技（上海）有限公司；Heracell 240i细胞培养箱，Denley Dragon酶标仪为美国 Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 方法

1.2.1 足细胞培养 液氮罐中冻存的小鼠足细胞复苏后，置于5%CO2培养箱中33℃进行培养，每瓶除加入10%FBS的生长培养基5ml外，同时加入γ-干扰素500U。待细胞贴壁生长至80%以上，加入胰蛋白酶室温下消化1～2min，待细胞变圆、间隙增宽时，终止消化，置37℃、5%CO2培养箱中培养（培养基不变，但不含γ-干扰素）使之分化成熟。37℃培养14～20d后，足细胞胞体变大，产生较多粗厚交错的足突，成为分化成熟的“树枝状”足细胞。

1.2.2 足细胞CCK-8检测标准的确定 将分化成熟且处于对数生长期的“树枝状”足细胞，按照以下数量接种于96孔板，1×103、2×103、4×103、8×103、10×103、20×103、40×103、80×103、100×103个/孔，各浓度均设置5个复孔培养12h待细胞贴壁生长后，吸走培养基，每孔加入含10%的CCK-8培养基100μl，分别孵育1、2、3、4h测OD450值。以每孔细胞数为横坐标，以去背景OD450值为纵坐标，获得细胞增殖标准曲线，从而确定CCK-8检测的最佳细胞数和时间。

1.2.3 高糖诱导足细胞的活性测定 按照1.2.2结果，将对数生长期的足细胞以10×103个/孔数量接种于96孔板，培养12h待细胞贴壁生长后，用同步化培养基饥饿培养12h，再换用含有以下浓度葡萄糖的培养基，即11.1（对照组）、16.1、21.1、26.1、31.1、36.1mmol/L诱导48h，每个浓度设置5个复孔。吸走培养基后，每孔加入含10%CCK-8的培养基100μl，按照1.2.2结果孵育3h后测定OD450值，来明确高糖对足细胞活性的抑制作用，并获得高糖的最佳诱导浓度。

1.2.4 TP或Val对高浓度葡萄糖环境下足细胞活性的影响 Val原粉以二甲基亚砜和无菌注射用水稀释后配置成4ng/μl溶液，再稀释成各实验浓度；TP原粉以二甲基亚砜和无菌注射用水稀释后配置成4×10-2mol/L溶液，再稀释成各实验浓度。足细胞接种培养同1.2.2，依据1.2.3的结果选用26.1mmol/L的高糖培养基诱导，并添加不同浓度TP或Val作为实验组。TP组设置T1、T2、T3、T4、T5组，TP浓度分别为4、8、16、32、64ng/ml；Val组设置V1、V2、V3、V4、V5组，Val浓度为2×10-8、2×10-7、2× 10-6、2×10-5、2×10-4mol/L。每个浓度均设置5个复孔，干预48h后，按照1.2.2结果孵育3h，测定OD450值。同时按照1.2.3结果设置高糖模型对照组（MC组，葡萄糖浓度为26.1mmol/L）和正常对照组（NC组，葡萄糖浓度为11.1mmol/L），获得药物最佳干预浓度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示；多组间比较采用单因素F检验；组间两两比较，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验。两变量间相关性分析采用直线相关分析。

2 结果

2.1 足细胞CCK-8检测标准的确定 以每孔细胞数为横坐标，去背景OD450值为纵坐标，获得小鼠足细胞增殖标准曲线。结果提示孵育3h，细胞数量10×102个～10×103个时，每孔细胞数目和去背景OD450值相关性最强（r=0.9995，P＜0.01），考虑后续实验需要干预48h，细胞需要维持一定数量，故以10×103个/孔接种最为合适，见图1。

图1 足细胞增殖标准曲线

2.2 不同浓度葡萄糖对足细胞活性的抑制作用 与NC组（11.1mmol/L葡萄糖组）相比，16.1mmol/L葡萄糖组足细胞活性无统计学差异（P＞0.05），其余各组足细胞活性均显著下降（P＜0.05或0.01），其中以26.1、31.1mmol/L葡萄糖组下降最明显（均 P＜0.01）；而26.1、31.1mmol/L葡萄糖组间比较，26.1mmol/L组下降更明显（P＜0.05）；36.1mmol/L组足细胞活性出现明显的反跳现象，与31.1mmol/L组比较具有统计学差异（P＜0.01），见表1。由此得出后续实验中的最佳葡萄糖糖诱导浓度为26.1mmol/L。

表1 不同浓度葡萄糖对足细胞活性的抑制作用

2.3 TP或Val对高浓度葡萄糖环境下足细胞活性的影响 与MC组比较，T1组足细胞活性无统计学差异（P＞0.05），其余各组足细胞活性均有不同程度增加，均有统计学差异（P＜0.05或0.01），其中以T3、T4组增加最显著（均P＜0.01）；而T3、T4组间比较，T3组增加更明显（P＜0.05）。但与NC组比较，TP各浓度组足细胞活性尚未完全恢复（P＜0.05或0.01），见表2。

表2 TP或Val对高浓度葡萄糖环境下足细胞活性的影响

与MC组相比，V1组足细胞活性无统计学差异（P＞0.05），其余各组均有不同程度增加，均有统计学差异（P＜0.05或0.01）；与V3组比较，V4组升高更明显（P＜0.01），V5组则无统计学差异（P＞0.05）。与NC组比较，Val各浓度组足细胞活性尚未完全恢复（P＜0.05或0.01），见表2。由此得出最佳TP干预浓度为16ng/ ml，最佳的Val干预浓度为2×10-5mol/L。

3 讨论

足细胞EMT已经成为DN蛋白尿研究中的热点，若能研究清楚并有效阻断该过程，将为DN蛋白尿的防治开辟崭新的前景。近来的研究显示，高浓度葡萄糖可以激活转化生长因子β1（TGF-β1）并通过TGF-β/Smad信号通路介导足细胞EMT的发生，并负反馈抑制Smad7的表达；同时检测到足细胞EMT发生的证据，即上皮细胞标志蛋白如足细胞裂孔膜蛋白（nephrin和podocin）、肾病样蛋白1抗体（NEPH1）、紧密连接相关蛋白ZO-1等的表达减少，以及间充质细胞标志蛋白desmin、纤维连接蛋白（FN）、整合素连接激酶（ILK）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）等表达增加[1，5]。发生EMT的足细胞，首先表现为足突减少、融合增加，其次细胞活性下降，导致与肾小球基底膜（GBM）的黏附作用下降而损伤滤过膜，形成早期蛋白尿；而长期的高浓度葡萄糖刺激除了加重足细胞EMT，还可直接导致足细胞发生坏死和凋亡[6]。目前认为足细胞EMT是早期和可逆的过程，因此阻断该信号通路，将会有效缓解或逆转足细胞EMT，从而可以减轻滤过膜损伤，防止蛋白尿的发生[7]。一些证据显示TP和Val可能与足细胞EMT和TGF-β/ Smad信号通路关系密切。

TP具有强烈的抗炎和免疫抑制作用，研究认为DN蛋白尿的进展是一种炎症反应，而且可被TP抑制，既往研究中已经获得了较多的证实，目前认为其具体机制可能与抑制足细胞EMT有关。已有小鼠实验证实，TP治疗后足细胞原本稀少的足突再次变得粗厚茂密，而与足细胞EMT相关的足细胞裂孔膜蛋白（nephrin和podocin）的表达和分布都出现了不同程度增加，而间充质细胞标志蛋白desmin则明显减少[4]。在另一项动物实验中也证实了TP通过降低肾脏组织中巨噬细胞的堆积和渗透从而减轻足细胞的损伤和凋亡，并能减少骨桥蛋白和TGF-β1的表达[8]。以上研究结果均显示了TP参与了抑制足细胞EMT的过程，但仍缺乏体外实验相关证据，其作用机制是否与TGF-β/Smad信号通路有关尚未完全明了。

作为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，Val一直被认为是通过血压控制降低肾小球内压和滤过率下降速度，从而起到减轻DN蛋白尿和保护肾脏的作用，但目前认为其可能存在降压效果以外的降低蛋白尿的机制[9]。在高血压合并DN的大鼠实验中，观察不同剂量的Val对大鼠血压和蛋白尿的影响，发现当Val超过120 mg/（kg·d）时，大鼠血压不再进一步下降，而蛋白尿却持续减低[10]。同时在Val治疗具有进行性蛋白尿表现的单肾切除DN小鼠时，不但显示蛋白尿减少，还出现了肾脏纤维化相关因子血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、FN、Ⅳ型胶原、TGF-β1等的表达减低，而足细胞EMT相关的足细胞裂孔膜蛋白（nephrin和podocin）表达明显增加[9]。但Val的作用机制是否与抑制足细胞EMT和参与TGF-β/Smad信号通路相关仍缺乏相关体外实验证据。本研究从细胞活性角度显示TP和Val可逆转发生了EMT的足细胞活性。实验采用CCK-8检测方法，根据试剂生成甲臜物数量与活细胞数量成正比，获取去背景OD450值反映足细胞活性，并通过组间比较明确药物干预作用，并取得最佳干预浓度。本法试剂单一，方便快速，对细胞无毒，灵敏度和重复性高于MTT法。

高浓度葡萄糖诱导研究发现，高浓度葡萄糖可促使足细胞活性下降，但随着葡萄糖浓度的增高，足细胞活性产生波动。与NC组相比，26.1、31.1mmol/L组足细胞活性明显下降，且两者中以26.1mmol/L组下降更明显。与NC组比较，36.1mmol/L组足细胞活性仍呈下降趋势，但与31.1mmol/L组比较，足细胞活性反而出现了明显回升，可能与足细胞对高浓度葡萄糖发生耐受有关。因此后续实验选择26.1mmol/L作为高浓度葡萄糖的干预浓度最具有意义。

药物干预研究发现，TP和Val都可不同程度逆转高浓度葡萄糖抑制的足细胞活性。与MC组相比，T3、T4、V3、V4、V5各组足细胞活性都有明显恢复；而T3、T4两组间比较，T3恢复更好；V3、V4、V5各组间比较，V4组恢复更好。与T4组相比，T5组出现了恢复减低；与T3组比较，T4组比恢复减低，这提示了TP逆转足细胞活性的作用存在阈值，T3附近即是转折点，超过转折点浓度后足细胞活性反而降低，间接说明了雷公藤类药物可能具有浓度依赖的不良反应。同样V3组和V5组无差异，与V4组相比足细胞活性恢复减低，提示V4附近存在转折点。与NC组相比，各药物组细胞活性尚未完全恢复，均有统计学差异。因此，笔者认为TP浓度在8～64ng/ml和Val浓度在2×10-7～2×10-4mol/L为有效干预浓度范围，其中以TP 16ng/ml和Val 2×10-5mol/L为最适干预浓度，但是TP和Val均可能存在浓度依赖的不良反应，尚需进一步研究证实。

本研究从足细胞活性角度表明，一定浓度范围的TP和Val可部分逆转高浓度葡萄糖抑制的小鼠足细胞活性，提示其对足细胞具有靶向保护作用，为进一步研究足细胞EMT和TGF-β/Smad信号通路相关因子提供了实验基础。

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Impact of triptolide and valsartan on inhibition of mouse podocyte activity induced by high glucose

HOU Pengchao,HONG Yuzhi, YE Xun.Department of Endocrinology,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University (Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital),Hangzhou 310007,China

Objective To investigate the impact of triptolide (TP)and valsartan (Val)on the inhibition of mouse podocyte activity induced by high glucose. Methods Matured mouse podocytes were cultured and randomly divided into control group (11.1mmol/Lglucose)and different high glucose groups(16.1,21.1,26.1,31.1 and 36.1mmol/Lglucose,respectively).Changes of podocyte activity were detected by CCK-8 after 48h incubated with different concentrations of glucose,and the appropriate concentration of glucose was screened.Then matured podocyte were randomly divided into different TP groups(4,8,16,32 and 64ng/ml TP,respectively)and Val groups(2×10-8,2×10-7,2×10-6,2×10-5and 2×10-4mol/L Val,respectively).The changes of podocyte activity were detected by CCK-8 after 48hrs incubation. Results Compared with controlgroup,the podocyte activity in different high glucose groups were significantly inhibited to varying degrees except that in 16.1mmol/L glucose group.The activity of podocyte was most significantly inhibited in 26.1mmol/L glucose group(P＜0.01).Compared with the 26.1mmol/L high glucose group,the podocyte activity of different TP and Val groups were significantly up-regulated to varying degrees except those of 4ng/mlTP group and 2×10-8mol/L Val group.The activity of podocyte was most significantly up-regulated by the 16ng/ml TP and the 2×10-5mol/L Val,respectively(P＜0.01). Conclusion Both triptolide and valsartan can partially rehabilitate the inhibition of mouse podocyte activity induced by high glucose.

High glucose Triptolide Valsartan Podocyte Activity impactCCK-8

2014-10-21）

（本文编辑：胥昀）

浙江省中医药科学研究基金计划A类（2012ZA097）；杭州市科委医疗卫生及重点专科专病科研攻关专项（20130733Q 16）

310007 杭州，浙江中医药大学附属广兴医院、杭州市中医院内分泌科

叶迅，E-m ai l：yexunonl i ne@163.com