王 智 孙计萍 周 继 朱依纯△

(1复旦大学基础医学院生理与病理生理学系 上海 200032; 2上海市小分子活性物质重点实验室 上海 200032)



硫化氢对高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪代谢的调控作用

王 智1,2孙计萍1,2周 继1,2朱依纯1,2△

(1复旦大学基础医学院生理与病理生理学系 上海 200032;2上海市小分子活性物质重点实验室 上海 200032)

目的 探讨给予外源性硫化氢(H2S)对肥胖小鼠脂肪代谢的调控作用。方法 将小鼠分为正常对照组、模型组和治疗组。正常对照组(n=10):给予正常小鼠饲料喂养;模型组(n=10):给予高脂饲料喂养12周建立饮食致胖(diet-induced obesity,DIO)模型;治疗组(n=15):同样建立成DIO小鼠并随机分3小组,分别给予25、50和100 μmol·kg-1·d-1NaHS治疗6周,期间继续给予高脂饲料。给药期间动态监测各组小鼠的体质量变化。治疗期满处死小鼠,检测附睾脂肪以及肾周脂肪重量,用自动生化仪和ELISA法分别检测小鼠血清中的游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)和抵抗素(resistin)脂肪因子水平。结果 与正常对照组比较,DIO模型组小鼠造模成功,体质量、附睾脂肪重量与肾周脂肪重量均有明显升高,但小鼠血清中的NEFA和resistin含量没有明显变化;与模型组相比,治疗各组小鼠附睾脂肪重量与肾周脂肪重量均有明显的回落(P<0.05),血清中的NEFA水平也明显降低(P<0.05),resistin含量没有显著变化。结论 H2S可以显著缓解DIO小鼠脂肪的堆积,降低治疗组血清中NEFA的水平,但对resistin脂肪因子无明显调控作用。

硫化氢; 饮食致胖; 游离脂肪酸; 抵抗素; 小鼠

近年来越来越多研究显示,脂肪代谢通过分解脂肪细胞中贮存的三酰甘油来产生大量的脂肪酸,参与β-氧化进而生成ATP为机体提供更多的热量;而脂肪组织不仅作为体内重要的脂质储存器官,同时也是体内最大的内分泌器官[1]。脂肪组织通过分泌多种脂肪因子,在各类代谢综合征、炎症、免疫反应以及肿瘤发生发展中都存在重要的调控作用[2]。因此,脂肪代谢与脂肪因子之间有着密不可分的关系。2014年,Zak等[3]发现游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)水平与代谢综合征疾病有密切的相关性;Wolfing等[4]对代谢综合征中脂肪因子分泌的水平进行了研究。Mancuso[5]的研究表明,肥胖的发生主要由脂肪细胞因子分泌紊乱、脂肪细胞异常增多以及细胞内脂质过度沉积产生。在能量代谢方面,脂肪因子能通过增加能量消耗,改善脂代谢水平,从而调节内分泌水平[6],有效预防肥胖以及代谢综合征的发生发展。根据报道,调控NEFA以及脂代谢相关因子抵抗素(resistin)水平,对肥胖相关性代谢综合征的预防与缓解,改善脂代谢水平,调节胰岛素抵抗方面有重要的作用[7]。NEFA可通过降低胰岛素受体数量,促进胰岛β细胞凋亡等介导糖尿病的发生,同时NEFA还可降低内皮依赖性血管舒张并影响平滑肌细胞功能,诱导高血压的发生[8-10]。研究还发现,NEFA在肾病等疾病的发生过程中也扮演了重要角色[11]。resistin是近年新发现的一种由脂肪细胞特异性分泌的多肽[12],它是脂肪形成的一种反馈调节因子,与机体肥胖、胰岛素抵抗等密切相关[13]。研究发现,它参与免疫反应、炎症等方面的作用,但resistin的作用机制尚不明确,需深入研究。近年来,人们发现控制NEFA和resistin水平的稳定,对防治2型糖尿病也起到一定作用[14]。

H2S是一种哺乳动物体内广泛生成的内源性气体小分子活性物质[15-16]。目前已知机体内能够产生H2S的酶主要是胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)、胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase,CBS)以及3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercap-topyruvate sulfurtransferase,3-MST)[17-18]。H2S在各系统中发挥了广泛的生理学保护作用,包括神经系统、心血管系统、消化系统、内分泌系统以及炎症免疫系统等,已成为继NO、CO之后的第3种气体信号分子[19]。Xue等[15]研究发现,H2S通过调节胰岛素受体(insulin resistance,IR)介导的信号通路,增加胰岛素敏感性、减轻胰岛素抵抗,改善糖代谢异常。Mani等[20]观察发现,内源性H2S缺乏可致动脉内皮细胞增殖和黏附分子表达增加,而外源性给予H2S后可缩小动脉硬化斑块并且改善血脂代谢异常。鉴于目前已知H2S对糖脂代谢有重要调控作用,本课题拟通过NaHS给药处理,观察外源性H2S对饮食至胖(diet-induced obesity,DIO)小鼠脂肪代谢的调控作用。

材 料 和 方 法

实验试剂及设备 NaHS购自美国Sigma公司;超敏小鼠抵抗素ELISA试剂盒购买自美国Millipore(R&D)公司;深低温冰箱(Heraeus HFU 486 PLUS-U14)购自合肥美菱股份有限公司;全波长酶标仪购自美国TECAN公司;低温高速离心机购自美国Thermo Scientific公司;微量移液器购自德国 Eppendorf 公司;体质量计购自上海精密科学仪器有限公司。

实验动物 4周龄SPF级野生型雄性C57BL/6J小鼠70只,购自上海市斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠采取自由觅食及饮水。饲养环境为25 ℃恒温,60%恒湿,每天10 h人工日照。本文动物实验均符合复旦大学动物实验伦理标准要求。

动物饲料 普通饲料(碳水化合物 65%,脂肪 20%,蛋白质15%)购自复旦大学动物房;高脂饲料(60%脂肪能量供比)购自上海斯莱克有限责任公司。

动物分组 适应环境喂养普通饲料(含20%脂肪能量供比)2周后,测其小鼠体质量,从18～23 g小鼠中随机挑选分为3组。第1组喂养正常普通饲料,作为正常对照组(n=10);第2组喂养高脂饲料(含60%脂肪能量供比),作为DIO模型组(n=10)。第3组同样喂养高脂饲料,建立成DIO小鼠模型,作为NaHS给药处理的治疗组(n=45)。不同方式喂养12周(小鼠达18周龄)后,治疗组随机分为3组给药处理,小鼠的体质量在3组间无显著性差异。

给药处理 第18周时开始连续6 周给药处理。正常对照组:腹腔注射生理盐水(100 μL/d); DIO模型组:腹腔注射生理盐水(100 μL/d); NaHS治疗组:DIO模型小鼠分别腹腔注射同体积的25、50、100 μmol·kg-1·d-1NaHS(NaHS溶液需每天用生理盐水新鲜配制)。每2周测量1次小鼠体质量。

血清中NEFA的指标检测 血清中NEFA水平委托上海市龙华医院检验科通用全自动生化仪进行分析检测。

ELISA法检测血清resistin水平 按照美国R&D公司ELISA Kit Protocol操作流程对血清中resistin水平进行检测,用全自动酶标仪在450 nm波长下测得各孔的吸光度(D值),通过标准曲线计算血清中resistin脂肪因子浓度。

结 果

小鼠体质量的变化以及外源性H2S对附睾脂肪重量和内脏脂肪重量的影响 喂养小鼠第18周时,检测正常对照组和DIO模型组小鼠的体质量,与正常对照组相比,DIO模型组小鼠的体质量均明显增加(P<0.05,图1A)。

Data represent means±SE.(1)vs.Normal-control group,P<0.01,(2)vs. DIO-control group,P<0.05.(Normal group,n=10;DIO-control group,n=10; DIO+25,50,100 μmol·kg-1·d-1,n=15 respectively).

图1 第6周正常对照组小鼠与NaHS处理的小鼠的体质量、附睾脂肪重量以及肾周脂肪重量的测定

Fig 1 The measure of body weight,epididymis adipose weight and perirenal fat weight in normal control and DIO mice with or without chronic NaHS treatment for 6-week

在给药处理6周后,对所有组小鼠的附睾脂肪以及肾周脂肪重量进行称量。与正常对照组比较,DIO模型组小鼠的附睾脂肪重量与肾周脂肪重量均有明显的升高,差异有统计学意义(P<0.05);此实验数据表明,DIO小鼠造模实验成功;与DIO模型组小鼠比较,治疗组给予50 μmol·kg-1·d-1NaHS处理后,DIO小鼠附睾脂肪重量与肾周脂肪重量均显著性降低(P<0.05),给予25或100 μmol·kg-1·d-1NaHS处理后附睾脂肪重量与肾周脂肪重量虽有下降趋势,但与DIO模型组相比没有统计学意义。表明在50 μmol·kg-1·d-1NaHS给药条件下,H2S能够明显减少附睾脂肪和肾周脂肪的堆积 (图1 B、C)。

正常对照组与DIO模型组小鼠脂肪组织重量与体质量的比值 经过高脂饮食诱导喂养后,发现DIO模型组与正常对照组小鼠相比,其附睾脂肪和肾周脂肪组织的总重量与体质量的比值(FW/BW)有明显的增加,差异有显著统计学意义(P<0.001)。如果根据总脂与体质量的比值增加做为肥胖判断标准之一,DIO模型组小鼠早已形成肥胖。治疗组给药50 μmol·kg-1·d-1处理后,与DIO模型组比,总脂与体质量的比值有明显降低(P< 0.05,表1)。

H2S对小鼠血生化指标的影响 给药处理6周,小鼠饥饿过夜后,测血清中糖脂代谢相关的生化指标变化。其中治疗组25 、50及100 μmol·kg-1·d-1NaHS分别给药处理后,血清中三酰甘油水平均有显著降低(P<0.05),而胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平与DIO模型组相比,未有显著变化(表2)。

表1 第24周不同组之间小鼠脂肪组织重量(附睾脂肪+肾周脂肪重量)与体质量的比值比较

GroupsFW/BWNormal-control0.98±0.27DIO-control2.45±0.79(1)DIO+25μmol·kg-1·d-11.73±0.64DIO+50μmol·kg-1·d-11.41±0.89(2)DIO+100μmol·kg-1·d-11.61±0.73

(1)vs.Normal-control group,P< 0.001;(2)vs.DIO-control group,P< 0.05.

表2 各组血清中三酰甘油、胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平的比较

Variable(mmol/L)TGCHOLHDL-CLDL-CNormal-control0.75±0.081.69±0.071.47±0.040.19±0.03DIO-control0.86±0.093.09±0.26(1)2.81±0.23(1)0.56±0.03(1)DIO+25μmol·kg-1·d-10.54±0.08(2)2.49±0.382.23±0.180.54±0.11DIO+50μmol·kg-1·d-10.39±0.14(3)2.53±0.312.44±0.220.41±0.10DIO+100μmol·kg-1·d-10.53±0.02(4)2.86±0.122.62±0.130.61±0.04

Effects of chronic NaHS treatment for 6 weeks on biochemical profiles in DIO mice.Data represent means±SE; TG:Triglyceride;CHOL:cholesterol; HDL-C;High density lipoprotein-cholesterol;LDL-C;Low density lipoprotein-cholesterol.(Normal group,n=10;DIO-control group,n=10; DIO+25,50,100 μmol·kg-1·d-1group,n=15 respectively).(1)vs.Normal-control group,P<0.001;(2)(4)vs.DIO-control group,P<0.05;(3)vs. DIO-control group,P<0.01.

H2S对小鼠血清中游离脂肪酸含量的影响 与正常对照组比较,DIO模型组小鼠的NEFA水平没有明显升高(P=0.255 8);与DIO模型组小鼠相比,3个剂量的治疗组小鼠血清中NEFA水平均有显著性降低,差异有统计性意义(P<0.05)。此研究表明,H2S对小鼠血清中NEFA含量具有明显的下调作用(图2)。

H2S对小鼠血清中抵抗素水平的影响 与正常对照组相比,DIO模型组小鼠血清中的resistin水平没有明显变化;与DIO模型组比较,治疗组中给药各个浓度下的小鼠其血清中resistin 水平没有发生明显改善,差异无统计学意义。表明H2S对小鼠血清中resistin水平没有显著的调控作用(图3)。

图2 给药不同浓度的硫氢化钠与血清中游离脂肪酸含量的关系

Fig2TherelationshipofdifferentconcentrationsNaHSandNEFAlevelinserum

图3 给药不同浓度的硫氢化钠与血清中抵抗素含量的关系

Fig3TherelationshipofdifferentconcentrationsNaHS and resistin level in serum

讨 论

目前,肥胖动物模型主要包括两类:基因缺陷型肥胖和饮食诱导型肥胖。常用的基因缺陷型肥胖模型主要包括以下几种:ob/ob小鼠、db/db小鼠、zucker糖尿病肥胖大鼠(ZDF)、多基因背景KK/Ay小鼠以及OLETF大鼠。其中ob/ob小鼠和db/db小鼠分别是C57BL/6J背景的瘦素基因[21]和瘦素受体基因突变[22-23]的小鼠;ZDF大鼠是从zuker肥胖大鼠(zucker fatty rat,ZF)中筛选出的糖尿病表型大鼠,带有瘦素受体突变基因[24-25];KK/Ay小鼠则是由KK小鼠编码调节皮毛颜色的Agouti基因突变导致的自发性肥胖糖尿病小鼠[26];OLETF大鼠是由于胆囊收缩素1受体缺失导致摄食过量引起的肥胖大鼠[27]。DIO模型主要是针对Wistar大鼠及C57BL/6J小鼠等给予高脂饲料或高浓度果糖饮水饲养诱导造模。由于DIO小鼠模型被广泛应用于肥胖和胰岛素抵抗等为特点的代谢综合征疾病研究中[28],又鉴于目前肥胖的流行发病趋势主要由摄取大量高热量饮食等造成,而DIO小鼠模型能更好地模拟当前大多数肥胖的发病原因。为此,本研究选择用DIO小鼠模型作为研究对象。我们选用60%脂肪能量供比的高脂饲料喂养6周龄雄性C57BL/6J小鼠,通过小鼠体质量明显增加、附睾脂肪以及肾周脂肪明显堆积,说明DIO小鼠造模成功。在第18周时DIO模型组小鼠比正常对照组体质量增重25.3%,在第24周时附睾脂肪重量和肾周脂肪重量分别增加59.3%和53.6%。另外,连续6周给药治疗下,观察到只有在治疗组50 μmol·kg-1·d-1NaHS浓度条件下,附睾脂肪和肾周脂肪的重量均有显著性下降,分别下降44.4%和35.4%,提示此浓度下外源性H2S可能对肥胖的治疗有改善效果。

长期以来,脂肪代谢在人体三大代谢系统中发挥着重要的调节作用,cAMP路径被认为是脂肪代谢重要的调节者,在调控脂代谢水平、脂肪细胞分化以及脂肪因子分泌等方面都起着重要的作用[6]。然而,随着近年来研究脂肪因子尤其是Leptin、TNF-α 异军突起,对脂肪代谢调节的认识有了更深入的研究。

H2S在近20年的医学与生物学研究发展中开始受到足够的重视[29],在治疗或控制肥胖及代谢综合征领域已有不少发现。Wu等[30]发现H2S能够减缓由高脂饮食导致肥胖的肾脏损伤;另外,Candela等[31]观察到肥胖中硫化氢损耗能够导致微血管的重建;2011年,Desai等[32]探究了H2S与代谢综合征的关系,表明硫化氢能够改善代谢综合征等并发症的现象。但H2S通过调控脂肪因子水平来改善肥胖及相关代谢性疾病,还少有报道。我们的研究结果显示,NaHS给药6周后,DIO小鼠的附睾脂肪与肾周脂肪重量有显著性降低,但小鼠体质量却没有明显减轻,究其原因可能与DIO小鼠的肝组织脂肪合成过多有关。有文献报道,通过高脂饮食诱导的肥胖型小鼠,其肝组织细胞脂肪氧化酶mRNA的表达下降和CPT-1的活性降低,从而引起肝组织脂肪堆积的现象[33]。另外,也有文献发现[34],在高脂饮食诱导后的小鼠体内其脂肪酸合成酶FAS活性下降以及其mRNA水平降低都与肝组织脂肪堆积相关。提示外源性H2S可能通过调节附睾脂肪细胞与肾周脂肪细胞的氧化还原状态,促进其脂肪氧化酶活性及mRNA的合成,抑制其脂肪酸合成酶的活性,使脂肪酸分解,导致脂肪重量的减轻。而H2S可能受到某些机制影响,对缓解肝组织脂肪堆积的作用不是很明显,所以小鼠体质量没有明显变化。但也有相应文献提出H2S对体质量变化相反的影响,通过表达产生内源性H2S酶CBS和CSE,发现当CBS及CSE基因缺失,导致蛋白表达量下降,会引起小鼠体质量的下降[35-36]。这说明内源性H2S水平降低可以导致体重减轻,从互补角度上也印证了外源性H2S对肥胖小鼠体质量没有明显影响的观点。此外,还有文献证明,抑制产生内源性H2S酶系统,能增强脂肪组织的分解,导致脂肪组织质量增加变缓;而给予H2S缓释供体,却抑制了脂肪分解作用,脂肪组织质量也无明显变化[37]。此结论与本研究有一定的矛盾之处,可能原因是内源性H2S对脂肪细胞的代谢与内分泌作用机制不同造成的,这还需要我们对内外源性H2S的作用机制进行深入对比研究。而本研究又发现,高脂饮食诱导后的模型组小鼠其血脂水平普遍有明显性升高,经外源性H2S给药处理后,TG水平有显著性降低,而TC与LDL-C水平却未显著性降低。根据文献报道,血液中近70 %的胆固醇(TC)是通过LDL和极低密度脂蛋白(VLDL)携带的,其中65 % ～ 70 %的LDL通过依赖肝细胞的LDLR(低密度脂蛋白受体相关蛋白) 途径清除[38]。而LDLR作为一种细胞表面蛋白,属于内吞性受体,其能调节血脂的动态平衡及纤溶功能的稳定,因此对控制血清中胆固醇含量处于正常动态平衡状态有重要的作用[39]。提示H2S可能阻碍或不能促进LDLR mRNA水平的增加,使其LDLR的表达下降,导致合成LDLR数量有所减少,因此LDL-C水平下降不明显,血脂TC水平变化也不明显。但这还需要大量实验去探究与验证。另外,H2S影响血脂中TG、TC等代谢的信号通路和具体的作用机制还需更深入的研究。

本研究还显示,H2S对于小鼠血清中的NEFA水平具有显著的降低作用,与DIO模型组相比,给药后治疗组血清中NEFA含量对应DIO+25、50、100 μmol·kg-1·d-1NaHS组分别下降40.4%、46.0%和49.1%,提示H2S能够明显下调NEFA水平,两者之间存在一种负相关性;根据前期的研究成果[15],我们认为H2S可能激活了胰岛素受体磷酸化,促进体内葡萄糖代谢,通过氧化还原反应间接导致脂肪细胞的三酰甘油水平降低,分解释放的NEFA减少,具体原因还需深入研究。H2S对血清中resistin水平的调控方面,与DIO模型组比较,给药条件下治疗组均无显著性变化。其对resistin是否有调控作用仍需进一步研究。

基于脂肪因子与肥胖及脂肪代谢等方面有着密切的关系,有效调控脂肪因子水平对体质健康以及控制体脂起着举足轻重的作用。本研究发现H2S对于调控NEFA水平具有明显的改善效果,这对预防肥胖及肥胖相关代谢疾病等方面都具有潜在的应用前景。但目前如何利用缓释的H2S供体来提供稳定生理浓度的H2S以及长期H2S给药,能否一直有效控制NEFA等血脂水平还存在很多不确定的因素,需进一步深入研究。

致谢 复旦大学基础医学院王铭洁副教授对本文进行了悉心的指导。

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The regulation of lipid metabolism by H2S in diet-induced obesity mice

WANG Zhi1,2, SUN Ji-ping1,2, ZHOU Ji1,2, ZHU Yi-chun1,2△

(1DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2ShanghaiKeyLaboratoryofBioactiveSmallMolecules,Shanghai200032,China)

Objective To explore the regulation of lipid metabolism by exogenous hydrogen sulfide (H2S) in mice serum. Methods Mice were divided into a normal group (n=10),a model group (n=10) and three treatment groups (n=15) of NaHS (25,50 and 100 μmol·kg-1·d-1) as exogenous H2S donor.The normal group was given a normal feed.The diet-induced obesity (DIO)model group mice were induced by using high-fat diet for 12 weeks.Treatment groups received different concentrations of NaHS in saline solution by daily intra peritoneal injection for 6 weeks since the 18thweek.Finally,at the end of treatment period,we measured the weight of epididymis adipose and perirenal fat after killing mice of treatment groups.Then the content of non-esterified fatty acid (NEFA) was measured by automatic biochemical analyzer and resistin level was measured with ELISA kit in mice serum. Results Compared with the normal group,the body weight,epididymis adipose weight and perirenal fat weight had obvious increase (P<0.05),but the levels of NEFA and resistin did not change significantly in model group; Compared with model group mice,the weight of epididymis adipose and perirenal fat and the level of NEFA had significant decrease in mice of treatment groups (P< 0.05),but the content of resistin had no obvious change. Conclusions Hydrogen sulfide could obviously reduce the fat accumulation of DIO mice and significantly decrease the serum level of NEFA in treatment groups,but its regulation on resistin was not obvious.

hydrogen sulfide; diet-induced obesity; non-esterified fatty acid; resistin; mice

国家自然科学基金(81230003,31471088)

R363

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.002

2016-09-07;编辑:王蔚)

△Corresponding author E-mail:yczhu@shmu.edu.cn

* This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81230003,31471088).