苏晓云，李文青，冯春梅，贺继平，崔建梅

（1.山西医科大学汾阳学院护理学系，山西 汾阳 032200；2.济宁市荣复军人医院精神科，山东 济宁 272000；3.四川省广安市精神卫生中心精神科，四川 广安 638000；4.山西医科大学汾阳学院解剖教研室，山西 汾阳 032200；5.中北大学体育学院运动医学教研室，太原 030051）

雌激素对去卵巢大鼠抑郁样行为及杏仁核NGF表达的影响

苏晓云1，李文青2，冯春梅3，贺继平4，崔建梅5

（1.山西医科大学汾阳学院护理学系，山西 汾阳 032200；2.济宁市荣复军人医院精神科，山东 济宁 272000；3.四川省广安市精神卫生中心精神科，四川 广安 638000；4.山西医科大学汾阳学院解剖教研室，山西 汾阳 032200；5.中北大学体育学院运动医学教研室，太原 030051）

目的通过观察雌二醇治疗对雌激素剥夺大鼠的抑郁样行为及杏仁核神经生长因子（NGF）含量的变化，探讨雌二醇治疗抑郁症的作用靶点及作用机制。方法健康成年雌性SD大鼠随机分为假手术组（SHAM组，n=10）、卵巢切除组（OVX组，n=10）及去卵巢雌二醇治疗组（OVX+E组，n=10）3组。雌二醇治疗8周后通过悬尾及糖水偏爱实验观察雌二醇对雌激素剥夺大鼠行为学的影响；随后用免疫组织化学方法测量和分析杏仁核NGF神经元的数量及面积。结果与SHAM组大鼠比较，OVX组大鼠糖水偏爱实验中糖水偏爱率显著下降（P＜0.01）、悬尾实验中不动时间延长（P＜0.01），血清雌二醇水平及杏仁核NGF表达均显著下降（P均＜0.01）；8周雌二醇治疗改善了去卵巢大鼠的抑郁样行为，与OVX组大鼠比较，血清雌激素水平及杏仁核NGF表达水平均显著增加（P均＜0.01）。结论雌二醇治疗改善了去卵巢大鼠的抑郁样行为，可能与雌二醇增加去卵巢大鼠的血清雌激素水平及增强杏仁核NGF的表达有关。

雌二醇；神经生长因子；杏仁核；抑郁

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抑郁症是一种由多种病因引起的精神障碍性疾病，具有高发病率、高致残率及高死亡率的特点。雌二醇主要由卵巢分泌，活性最强，它不仅调节机体的生殖活动，还参与情绪反应和神经保护等诸多生理功能，与抑郁症等精神神经系统疾病密切相关［1］。流行病学研究［2］表明，围绝经期即更年期女性由于雌激素水平波动对外界刺激的调节能力下降，更容易患与应激有关的精神疾病，如抑郁症和创伤后应激障碍，患病率是同龄男性的2～3倍，并且病程更长、复发率更高。

杏仁核是叶边缘结构对情绪刺激的处理至关重要的大脑区域，与情绪记忆的调节及情感行为的形成有关［3］。且研究［4］表明，杏仁核是雌激素作用的靶点之一，而且在某种程度上与卵巢摘除引起的抑郁样行为有关。神经生长因子（nerve growth fac⁃tor，NGF）是一种重要的神经营养因子，在边缘结构海马及杏仁核表达较多，与情绪及认知功能有关，在神经细胞生存、神经可塑性及学习记忆方面起重要的调节作用。最近研究表明，雌激素可以通过调节神经营养因子的NGF表达产生神经营养作用，从而产生抗抑郁作用，因此，去卵巢导致的类抑郁样行为可能是通过调节大脑特定区域NGF的表达实现的。

本研究采用双侧卵巢摘除术建立大鼠围绝经期抑郁模型，观察雌激素对围绝经期抑郁模型大鼠行为学的影响，测试杏仁核NGF表达的变化，探讨雌二醇改善围绝经期抑郁模型大鼠抑郁样行为的可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

雌性健康成年（3月龄）SD大鼠30只，体质量220～250 g，均购于山西医科大学动物饲养中心（动物许可证号SCXK⁃2009⁃0001）。室温（23±1）℃，湿度55%±10%，光暗周期为（12 h照光/12 h黑暗），大鼠自由摄食、饮水。适应环境1周后，将30只大鼠随机分为：假手术（sham operation，SHAM）组、卵巢切除（ovariectomized，OVX）组、去卵巢雌二醇（ovari⁃ectomized rats treated with estradiol，OVX+E）组3组。OVX+E组大鼠每天上午9时至10时腹腔注射苯甲酸雌二醇（1 mg/mL），0.1 mL/只，连续8周。

1.2卵巢切除模型建立及检验

手术操作如HEYDARPOUR等［5］所述，腹腔注射50 mg/kg乌来糖麻醉大鼠，剃毛暴露皮肤进行双侧卵巢切除术，在鼠腰椎处作1 cm长的纵形切口，分离皮下，结扎输卵管及支配卵巢的血管，剪除两侧卵巢，逐层缝合肌肉和皮肤，术后连续3 d肌注20万U青霉素。术后1周做大鼠阴道涂片检测，造模成功的标志为连续5 d阴道监测未见动情周期。SHAM组手术操作步骤与OVX组相同，只切除腹腔内一小块脂肪组织，卵巢不切除。

1.3行为学测试

1.3.1悬尾实验（tail suspension test，TST）：雌二醇治疗8周后所有大鼠进行行为学测试。按LU等［6］描述的方法，大鼠尾部被胶带黏在距离地面60 cm的制铁架台上，用上方的摄像头记录大鼠6 min的悬尾活动情况，观察者通过回放录像记录大鼠最后4 min悬尾不动时间。

1.3.2糖水消耗实验：参照WALF等［7］描述的方法，大鼠单笼喂养，每笼同时放置2个水瓶。第1天，2个水瓶均装1%的蔗糖水；第2天，1瓶装纯水，1瓶装1%的蔗糖水，禁食禁水23 h后给予大鼠纯水及1%蔗糖水各1瓶，测量大鼠1 h内饮用纯水及蔗糖水的重量。糖水偏爱率（%）=［饮用糖水量/（糖水量+纯水量）］×100，该指标降低反映大鼠的快感体验能力下降。

1.4血清雌二醇水平测试

行为学测试结束后，所有大鼠经心脏取血2 mL，4℃、3 000 r/min离心10 min，分离血清收集在EP管中，-20℃保存。采用放射免疫分析法按雌二醇测定试剂盒操作方法测试大鼠血清雌二醇水平。

1.5杏仁体NGF石蜡切片制备

大鼠经戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉固定，冷生理盐水300 mL快速经左心室主动脉灌入、多聚甲醛150 mL缓慢灌注，至大鼠颈部僵硬，肝脏变白后用镊子取脑，放入多聚甲醛中固定4～6 h，石蜡包埋后脑组织冠状位切片（片厚5 μm），用于NGF免疫组化检测。

1.6免疫组化染色

石蜡切片经乙醇常规脱蜡至水，3%过氧化氢溶液室温孵育30 min封闭内源性过氧化物酶，切片上滴加NGF一抗单克隆抗体（1∶100），4℃孵育24～48 h，0.1M PBS液洗5 min×3次，加入生物素化山羊抗小鼠lgG（博士德生物公司），室温孵育30 min，之后按DAB显色试剂盒进行显色，镜下观察，苏木素复染，乙醇梯度脱水、二甲苯透明2次，自来水充分漂洗，干燥后中性树脂封片。

1.7杏仁核NGF图像分析

用Olympus BX50型显微镜摄像，采用图像分析系统对拍摄图片进行图像分析。每组随机抽取10张切片，分别测量杏仁核NGF 400倍阳性细胞数及面积。

1.8统计学分析

2　结果

2.1雌激素对去卵巢大鼠血清雌激素水平的影响

与SHAM组［（25.78±3.56）pg/mL］比较，OVX组大鼠血清雌二醇水平［（8.76±1.0）pg/mL］显著下降（P＜0.01），下降幅度为66%，去卵巢大鼠经过雌激素8周治疗，OVX+E组大鼠雌激素水平［（26.84± 4.45）pg/mL］显著增加（P＜0.01），平均水平稍高于SHAM组，但无统计学意义（P＞0.05）。

2.2雌二醇对去卵巢大鼠抑郁样行为的影响

糖水偏爱实验用于反映抑郁症核心症状快感缺失的实验。与SHAM组（84.65%±9.63%）比较，OVX组大鼠糖水消耗百分比（59.78%±7.91%）显著降低（P＜0.01），下降幅度为29.38%；给予去卵巢大鼠雌激素替代治疗8周能够明显逆转上述现象（P＜0.01），OVX+E组大鼠糖水消耗百分比与SHAM组比较无统计学差异（P＞0.05）。这一结果提示雌激素治疗可引起去卵巢大鼠快感增强。见图1。

图1　大鼠糖水偏爱实验结果Fig.1　Results of sucrose preference test in rats

悬尾实验用于反映动物的绝望行为。与SHAM组［（98.88±12.78）s］比较，OVX组大鼠悬尾不动时间［（155.34±23.65）s］显著延长（P＜0.01），延长幅度为29.38%；OVX组大鼠给予雌激素治疗后悬尾不动时间［（92.56±9.89）s］显著缩短（P＜0.01），缩短时间下降幅度为40.41%；且OVX+E组大鼠悬尾不动时间与SHAM组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图2。

图1　大鼠悬尾实验结果Fig.1　Results of tail suspension test in various group rats

2.3雌二醇对去卵巢大鼠杏仁核NGF表达的影响光镜观察SHAM组、OVX组及OVX+E组3组大鼠杏仁核NGF的免疫阳性反应情况，与SHAM组比较，OVX组大鼠杏仁核NGF着色稍淡，阳性细胞数目及面积均显著减少（P均＜0.01），下降幅度为27.63%及27.72%；经过8周雌二醇治疗，与OVX组大鼠比较，OVX+E组大鼠杏仁核NGF着色较深，阳性细胞数目及面积均显著增多（P均＜0.01），增加幅度分别为65.03%及67.05%；并且与SHAM组比较，OVX+E组大鼠杏仁核NGF显著增强，细胞个数及面积均显著增多（P均＜0.05）。见表1，图3、4。

3　讨论

多数学者［8］认为，围绝经期及绝经期女性由于雌激素水平的下降增加了患抑郁症的敏感性。卵巢是合成雌激素的最主要器官，卵巢切除之后，血液中雌激素含量将明显降低，本研究已经证实，去卵巢大鼠雌激素水平显著下降。此模型可以很好地模拟绝经期女性雌激素含量低下，并且去卵巢大鼠糖水偏爱率减少，悬尾实验中大鼠不动时间延长，说明卵巢摘除大鼠出现了兴趣丧失、快感缺乏及行为绝望等抑郁行为的核心症状。以前学者［9］通过强迫游泳行为学测试发现，雌二醇治疗可以减少强迫游泳实验中大鼠不动时间、增强去卵巢大鼠游泳时间。BASTOSA等［10］发现去卵巢大鼠海马及杏仁核注射雌二醇会导致大鼠焦虑和抑郁行为的减弱。本研究得到了相同结果，去卵巢大鼠给予雌二醇替代治疗8周雌激素水平恢复到正常，与SHAM组比较无统计学差异，说明雌二醇治疗能够改善去卵巢大鼠的抑郁样行为，增强快感、改善绝望及无助行为，结果说明，雌激素具有抗抑郁作用。

杏仁核是神经反应的关键组成部分，患有重性精神疾病的患者出现杏仁核结构和功能的异常［11］。核磁共振研究［12］发现，抑郁患者的杏仁核容量增大。NGF在保持突触可塑性及神经元的结构和完整方面起着重要作用，对应激引起的神经系统疾病及神经退化疾病方面起重要调节作用［13］。大量研究［14］证实，多种应激可以调节大脑NGF的表达，并且应激对NGF的影响取决于应激的种类及持续时间。DWIVEDI等［15］研究发现重性抑郁症自杀者额叶皮层的NGF蛋白水平显著下降，而且动物实验［16］证实暴露在急、慢性应激的大鼠NGF水平均显著下降。BJORLING等［17］研究发现卵巢切除可引起NGF蛋白含量明显下降，短期雌激素或孕激素治疗会增加大鼠NGF mRNA含量，使其含量恢复到正常大鼠水平。当前研究结果显示，大鼠卵巢切除作为一种应激刺激源会引起杏仁核NGF表达减少，提示杏仁核NGF在雌性大鼠雌激素剥夺致抑郁样行为中可能发挥了重要作用。OVERSTREET等［18］证实给予抑郁大鼠一定剂量的NGF可产生抗抑郁作用，强迫游泳实验中不动时间缩短，挣扎时间延长。因此，可以推测雌激素剥夺大鼠糖水偏爱中糖水偏爱百分比下降、悬尾实验中不动时间延长等无助、绝望及快感下降等抑郁行为与杏仁核NGF的表达减少有关。临床研究［19］认为，雌二醇替代疗法可有效恢复自然绝经或手术后卵巢切除患者的情绪障碍，STRADA⁃CAMARENA等［20］证实雌激素具有抗抑郁作用，并且注射雌激素可以逆转抑郁模型的无助行为及提高海马可塑性［21］。研究［22］认为，雌激素可以通过调节NGF水平及其受体发挥神经营养作用。杏仁核是含雌激素受体最多的大脑区域之一，因此可以推测，雌激素替代治疗可以通过提高雌激素受体的表达介导NGF的表达，发挥神经营养作用，维持大脑的正常结构，改善长期雌激素剥夺大鼠的抑郁样行为，具体机制需进一步研究。

表1　各组大鼠杏仁核NGF表达结果（x±s，n=10）Tab.1　Results of amygdala NGF expression in various groups of rats（x±s，n=10）

图3　杏仁核冠状定位 ×40Fig.3　Amygdaloid nucleus in stereotaxic coordinates×40

图4 杏仁核NGF表达 ×400Fig.4　Amygdaloid nucleus NGF expression×400

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（编辑于溪）

Effects of Estradiol on Depressive Behavior and Amygdaloid NGF Expression in Ovariectomized Rats

SU Xiaoyun1，LI Wenqing2，FENG Chunmei3，HE Jiping1，CUI Jianmei4
（1.Department of Nursing Humanities Teaching and Research Section，Fenyang College of Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China；2.Department of Psy⁃chiatry，Rongfu Military Hospital of Jining，Jining 272000，China；3.Department of Psychiatry，Mental Health Center of Guang’an in Sichuan Province，Guang’an 638000，China；4.Department of Anatomy Teaching and Research Section，Fenyang College of Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China；5.Department of Physical Education，North University of China，Taiyuan 030051，China）

ObjectiveTo observe the changes of the depressive behavior and amygdaloid nucleus nerve growth factor（NGF）expression in estro⁃gen⁃deprived female rats and explore the possible mechanism and targets of estradiol in depression treatment.MethodsA total of 30 adult SD fe⁃male rats were randomly assigned to 3 groups：sham operation group（SHAM，n=10）；ovariectomized group（OVX，n=10）and ovariectomized rats treated with estradiol group（OVX+E，n=10）.The behavior changes were observed by tail suspension test（TST）and sucrose preference test（SPT）after 8⁃week estradiol treatment.Subsequently，immunohistochemical staining detect NGF expression in amygdaloid nucleus.Results Compared with the SHAM group rats，sucrose preference ratio significantly decreased in SPT（P＜0.01），immobile time prolonged in TST（P＜0.01），serum estradiol level and amygdaloid NGF expression significantly decreased（allP＜0.01）.8⁃week estradiol treatment ameliorated depres⁃sion⁃like behavior and increased serum E2 level and NGF expression in amygdaloid nucleus in OVX+E group rats when compared with the OVX group（allP＜0.01）.ConclusionEstradiol treatment can improve the depressive behavior of ovariectomized rats，which may be related to the in⁃crease of serum estradiol level and the expression of NGF in amygdaloid nucleus.

estradiol；nerve growth factor；amygdaloid nucleus；depression

R749

A

0258-4646（2016）12-1119-05

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.014

苏晓云（1982-），女，讲师，硕士.

贺继平，E-mail：1666485669@qq.com

2016-04-05

网络出版时间：