于紫燕，王春霞，孙琦，赵江月，张劲松

（中国医科大学附属第四医院眼科，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005）

3种小鼠晶状体组织石蜡切片固定液的比较

于紫燕，王春霞，孙琦，赵江月，张劲松

（中国医科大学附属第四医院眼科，辽宁省晶状体学重点实验室，沈阳 110005）

目的比较3种固定液对小鼠晶状体组织石蜡切片的影响，优化小鼠晶状体组织石蜡切片固定方法。方法选取3种常用固定液（改良Davison’s固定液、传统Davison’s固定液和10%中性甲醛固定液），固定小鼠晶状体组织，并制成石蜡切片，经HE染色后在显微镜下观察。结果传统Davison’s固定液固定的晶状体组织切片无碎裂，改良Davison’s固定液固定的晶状体组织中央区碎裂。改良Davison’s固定液和传统Davison’s固定液固定的小鼠眼球外形均无明显变形和收缩，未见明显的视网膜脱离，镜下视网膜组织结构完整清晰，各层细胞排列紧密，无明显裂隙，染色鲜艳。采用10%中性甲醛固定液固定的小鼠眼球壁组织发生严重皱缩，晶状体组织皱缩，空隙和空泡形成。结论传统Davison’s固定液固定的小鼠眼球晶状体组织石蜡切片质量效果优于改良Davison’s固定液和10%中性甲醛固定液。

小鼠眼球；石蜡切片；固定液；晶状体

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小鼠晶状体由晶状体囊、晶状体上皮、晶状体纤维和悬韧带组成，各结构软硬度不同。在小鼠晶状体的石蜡切片标本制作过程中极易发生组织碎裂、细胞变形、组织皱缩以及脱水不完全，甚至出现裂隙、空泡，导致晶状体石蜡切片质量欠佳，不利于后期的组织学研究［1］。小鼠及胚鼠眼球组织体积小，传统“开窗”方法不适用，人为操作易引起眼内结构破坏。由于眼球组织结构的特殊性，在石蜡切片制作过程中，需要选择合适的固定液并做特殊处理。因此，本研究选择了3种不同的固定液，对比观察其对小鼠眼球晶状体组织石蜡切片质量的影响，旨在寻找合适种类的固定液，以提高小鼠眼球晶状体标本的切片质量。

1　材料与方法

1.1实验材料

健康C57BL/6 SPF级21日龄（P21）小鼠6只（12个眼球），由美国南加州大学Doheny眼科研究所提供，常规处死。

1.2固定液配制及固定方法

1.2.13种固定液：（1）传统Davison’s固定液（A）由2%甲醛，35%无水乙醇，10%冰乙酸，53%蒸馏水按比例配制。（2）改良Davison’s固定液（B）由30%甲醛，15%无水乙醇，5%冰乙酸，50%蒸馏水按比例配制。（3）10%中性甲醛固定液（C）。

1.2.2固定方法：取C57BL/6背景P21小鼠眼球，保留约1 mm视神经，生理盐水清洗后，立刻分别投入3种固定液中，每种固定液各4个小鼠眼球标本。室温下充分固定1 h，置换同类固定液室温固定23 h，置入70%乙醇中保存。

1.2.3组织脱水及透明：用70%、80%、95%乙醇Ⅰ，95%乙醇Ⅱ，95%乙醇Ⅲ，无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ各1 h行组织乙醇脱水。二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ各1 h透明。浸蜡65℃2 h。

1.3包埋与切片

1.3.1包埋：将小鼠眼球标本转移到预热的包埋框中，按照眼球前后径方向调整位置，放底板，倒入适量熔蜡，室温放置，使石蜡凝固。

1.3.2切片：用石蜡切片机切取石蜡切片，厚度为5μm，室温干燥过夜。

1.4HE染色

苏木精5 min，水洗去浮色；1%盐酸乙醇分色；伊红5 min。用70%、80%、95%乙醇，100%乙醇Ⅰ，100%乙醇Ⅱ进行梯度脱水各1min。二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ各5 min，封片，显微镜下观察。

2　结果

2.13种固定液固定后的小鼠眼球标本大体观察

肉眼观察：12个小鼠眼球标本经过固定后，A组和B组外观和颜色均无明显变化，能保持原有的形态，无皱缩和凹陷；C组外观和颜色无明显变化，眼球局部皱缩凹陷变形。

2.23种固定液处理后小鼠眼球晶状体组织石蜡切片HE染色结果

3种固定方法制备的小鼠晶状体组织石蜡切片标本进行HE染色后，差异如下：A组标本镜下见眼内结构及细胞形态正常，晶状体组织结构完整清晰，中央区无破碎，细胞排列整齐有序，对比度好，染色鲜艳（图1A）。B组标本镜下见眼内结构及细胞形态正常，晶状体组织结构基本完整清晰，中央区有不同程度破碎、脱片、染色不连续（图1B）。A组标本和B组标本视网膜结构均精细清晰、细胞排列紧密整齐，视网膜细胞和各层核膜清晰，细胞无收缩、膨胀、自溶（图1A、1B）。C组标本镜下见晶状体和视网膜结构基本完整，染色鲜艳，但晶状体中央区内出现组织破裂，细胞可见收缩变形以及排列乱序，眼球壁出现皱缩，视网膜组织可见脱落、变薄，视网膜细胞，尤其是视锥细胞、视杆细胞和双极细胞皱缩明显，各层细胞不清晰（图1C、1D）。

图1　不同固定液固定的小鼠眼球石蜡切片HE染色Fig.1　HE staining of mice eyeball tissues fixed with three different fixatives

3　讨论

影响石蜡组织切片质量的因素很多，固定液是关键的影响因素之一［2］。化学成分的渗透力、pH值、固定时间等诸多因素都可影响固定效果［3］。在晶状体发育生物学研究中需要观察晶状体、视网膜及眼内其他组织形态学变化，而小鼠晶状体组织包括晶状体囊膜、皮质和核3种结构，各结构硬度不同，对不同固定液反应不同，组织间相互作用能导致晶状体组织切片破碎，甚至脱片。因此，在针对小鼠眼球进行的实验研究中，需要一种能够取得较好固定效果的固定液，而且固定液和固定时间的选择尤为重要［4］。

10%中性甲醛对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，10%中性甲醛溶液具有渗透性较强，固定均匀，收缩性小，利于组织硬化、保持弹性等优点［5］。但传统的10%中性甲醛含有较多磷酸盐，渗透压较高，经乙醇脱水后收缩较大，眼内外各组织所受压力不同，容易引起眼球变形。由于眼球组织的特殊结构，10%中性甲醛固定液很难有效、快速地渗透入坚硬的晶状体组织内部，导致晶状体组织固定不佳，出现碎片或脱片。10%中性甲醛固定液作为晶状体石蜡切片标本固定液，效果并不理想，因此，为了获得适应组织学和多种免疫组化要求的小鼠眼球标本，需要优选1种可保持眼内组织结构完整及较好的抗原免疫原性的固定方法［6⁃7］。

Davidson’s固定液中加入了冰乙酸，能快速地渗透入坚硬的晶状体组织，加快晶状体组织固定的速度，固定效果更好［8］。冰醋酸对组织有膨胀作用，甲醛对组织有收缩作用［8］，2种试剂混合使用，可以相互作用，避免组织膨胀和收缩。乙醇也可用于固定组织，有收缩和硬化组织的作用，浓度越大，组织收缩硬化作用越明显［9⁃10］，75%的乙醇比95%的乙醇能更好地抵消冰醋酸对组织的膨胀。所以，传统的Davidson’s固定液乙醇和冰乙酸浓度高，甲醛浓度低［11］，晶状体软化效果好，小鼠晶状体组织固定效果好；改良的Davidson’s固定液能使眼球巩膜软化，易于脱水、浸蜡和切片，降低视网膜与球壁分离的概率［12⁃13］，固定小鼠视网膜标本效果好。

综上所述，改良的和传统的Davidson’s固定液都是优良的小鼠眼球标本石蜡切片固定液，固定效果优于10%中性甲醛。传统Davison’s固定液对小鼠眼球晶状体组织软化及固定效果好，改良的Da⁃vidson’s能降低小鼠视网膜与球壁分离的概率，对小鼠视网膜标本固定效果好。因此，传统Davison’s固定液是小鼠晶状体组织的首选固定液，而改良Davison’s固定液是小鼠眼球视网膜组织的首选固定液。

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（编辑王又冬）

Comparison of Fixation Effects of Three Different Complex Fixatives on Mouse Lens Tissue

YU Ziyan，WANG Chunxia，SUN Qi，ZHAO Jiangyue，ZHANG Jinsong
（Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Lens Science Research Key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China）

ObjectiveTo compare the effects of three kinds of fixative solutions on paraffin section of mouse lens tissue and optimize the fixing⁃method of paraffin section in mouse lens tissue.MethodsThree kinds of conventional fixatives were selected for the test，including the conven⁃tional Davison’s solution，modified Davison’s solution and 10%neutral buffered formalin.Mice eyeball tissues were fixed with three different fixa⁃tives，embedded，sliced and then stained with HE method.The paraffin slices were observed under the light microscope.ResultsThe structures of lens and retina fixed in conventional Davison’s fixative solutions were clear and intact，and the cells were arranged regularly and compactly. There was no eyeball distortion，contraction and retinal detachment in the eyeballs fixed in modified and conventional Davison’s fixative solution. However，the ones fixed in 10%neutral buffered formalin showed eyeball distortion and contraction，space and spherules.ConclusionThe mice lens slides made from tissues fixed by conventional Davison’s fixative solution are better than fixed by modified Davison’s fixative solution and the 10%neutral buffered formalin fixed ones.

mouse eyeball；paraffin slice；fixative solution；lens

R36

B

0258-4646（2016）12-1063-03

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.12.002

辽宁省自然科学基金（201602872）；沈阳市科学技术计划（F13⁃318⁃1⁃09）

于紫燕（1981-），女，主治医师，博士.

赵江月，E-mail：zhaojiangyue@hotmail.com

2016-04-27

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