李健荣，赵 鹏，徐鹏刚，坚晋卓，彭德良，李惠霞

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州 730070;2.中国农科院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)



甘肃天祝农牧区燕麦田孢囊线虫调查及种类鉴定

李健荣1，赵 鹏1，徐鹏刚1，坚晋卓1，彭德良2，李惠霞1

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州 730070;2.中国农科院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

为了明确甘肃天祝农牧区燕麦田孢囊线虫的发生情况及种类，2014年8-9月，采用Z字型取样法，对天祝燕麦主要种植区进行了调查。结果表明，采集到的80份燕麦根际土样中孢囊线虫发生率为44%，孢囊密度为4.3个·100 g-1土样。安远镇的发生率最高，为54.2%，华藏寺的发生率最低，为14.3%。孢囊浅褐色，阔柠檬形，长571 μm(447～727 μm)，宽449 μm(375～595 μm)。阴门双膜孔，膜孔长31 μm(28～33 μm)，膜孔宽16 μm(13～20 μm )，阴门裂长9 μm(8～11 μm )，泡状突明显，未见阴门下桥。天祝5个乡镇孢囊线虫rDNA-ITS区片段长度均为1 045 bp，经Blast比对发现，所测序列与燕麦孢囊线虫(Heteroderaavenae)的ITS序列相似度达99%～100%。系统进化关系分析显示，天祝孢囊线虫与国内及国外燕麦孢囊线虫在同一个大的进化分支，与中国的燕麦孢囊线虫在同一个小的分支。因此，形态特征结合rDNA-ITS序列分析将甘肃天祝燕麦田的孢囊线虫鉴定为燕麦孢囊线虫。

天祝；农牧区；燕麦；孢囊线虫

禾谷孢囊线虫(Cereal cyst nematode，简称CCN)是危害禾谷类作物的病原线虫，是一个复合种群，包含12个有效种，其中广泛分布且有经济意义的有燕麦孢囊线虫(Heteroderaavenae)、菲利普孢囊线虫(H.filipijevi)和麦类孢囊线虫(H.latipons)[1]。其中燕麦孢囊线虫的危害最严重、分布最广泛。1924年，禾谷孢囊线虫在德国阿切斯莱本的燕麦上被发现[2]，目前在亚洲、欧洲、美洲和澳洲40多个国家均有危害[3]。在沙特阿拉伯，该线虫造成40%～92%的小麦减产；在巴基斯坦，该线虫造成小麦产量损失15%～20%；在澳大利亚，该线虫造成23%～50%的小麦减产[4]。我国首次于1989年在湖北天门发现禾谷孢囊线虫病以来，相继在山西、江苏、天津、河南、山东、陕西、河北、北京、宁夏、安徽、青海、甘肃、内蒙古、新疆和西藏等15个省(市、区)相继发现[5-10]，给我国粮食安全带来了极大的威胁。在我国，燕麦孢囊线虫可造成20%～30%的小麦减产，严重时更造成50%以上的产量损失[11]。杨传广等[12]报道，燕麦孢囊线虫可使小麦株穗数减少13.8%，鲜重降低14.5%，最终导致小麦减产。

彭德良等[13]于2007年首次在甘肃省发现燕麦孢囊线虫病。李惠霞等[14]在甘肃省小麦和大麦主产区均发现燕麦孢囊线虫病。叶文兴等[15]对甘肃省孢囊线虫rDNA-ITS和28SrDNA-D2/D3区序列特征及ITS-RFLP分析，认为危害甘肃小麦的是燕麦孢囊线虫。柳永娥[16]通过rDNA-ITS区序列特征分析，确定甘肃省孢囊线虫为燕麦孢囊线虫。燕麦孢囊线虫的寄主范围十分广泛，包括小麦、青稞、燕麦、野燕麦、大麦、黑麦草、鹅冠草、苇状羊茅、鸭茅等禾本科植物[17]。李惠霞等[18]发现危害天祝高寒草原牧草的孢囊线虫是燕麦孢囊线虫。燕麦作为天祝农牧交错带十分重要的牧草饲料，其是否也受到孢囊线虫的危害以及受到何种孢囊线虫的危害尚不明确。因此，本研究通过对甘肃天祝主要农牧区燕麦田取样调查，利用形态学特征结合核糖体DNA-ITS序列分析鉴定线虫种类，旨在了解该地区燕麦田孢囊线虫病的分布情况及病原的种类，为燕麦线虫病害的及时控制和进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 土样的采集

于2014年8-9月燕麦扬花至灌浆期，在天祝县华藏寺镇、打柴沟镇、安远镇、石门镇、抓喜秀龙乡等五个乡镇20个村，采用Z字形取样法采集土样80份，每块地采集20～30个点，装入塑料袋作为1份样品。用GPS定位系统记录当地经纬度、海拔并记录地名，写好标签，带回实验室备用。采样信息详见表1。

1.2 孢囊的分离与计数

采用简易漂浮分离法[19]，将土样混匀后取100 g置于塑料桶中，加水搅拌，使土块完全溶解，静置2～3 min后，将悬浮液倾入26目和65目的套筛中，重复冲洗3次。然后小水冲洗，使大杂物留在26目筛上，而孢囊和小杂物留在65目筛上。弃去26目筛上的杂物，将65目筛上的混合物轻轻搓洗，直至洗去土壤颗粒。用洗瓶将孢囊混合物冲至100目的纱布上，置于滤纸上。在解剖镜下计数。每个样点随机取5个饱满孢囊，挤破检测孢囊卵粒数。

1.3 孢囊线虫形态学鉴定

每个样点随机挑取20个饱满孢囊，测量孢囊、卵的长、宽和二龄幼虫的体值。取部分饱满孢囊切取阴门锥，制成玻片后，在显微镜下直接观察，对孢囊线虫种类进行初步鉴定。阴门锥标本的制作参照冯志新[20]的方法，在光学显微镜下观察其形态特征、拍照、测量和鉴定。二龄幼虫标本的制作依据谢 辉[21]的方法，将盛有二龄幼虫悬浮液的试管放入65 ℃的水浴锅中加热2 min，用FAA(福尔马林-冰醋酸-乙醇固定液)固定。以水做浮载剂，将固定好的线虫挑入，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察、拍照、测量和鉴定。

1.4 孢囊线虫的分子鉴定

1.4.1 孢囊线虫DNA的提取

参考彭德良等[22]的方法，挑取单个饱满的孢囊置于Eppendorf管中，加入10 μL灭菌重蒸水、3 μL蛋白酶K(600 μg·ml-1)、7 μL的10×PCR-buffer(含Mg2+)。放入盛有液氮的双层保温桶速冻1 min，取出后用玻璃棒研磨1～2 min后，置于-20 ℃冷冻至少2 h。将Eppendorf管置于65 ℃下温育1.5 h，95 ℃ 10 min，4 ℃至少5 min，最后-20 ℃保存备用。

1.4.2 孢囊rDNA-ITS的PCR扩增、电泳及测序分析

PCR反应采用50 μL体系，线虫通用引物AB28(F：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)与TW81(R：5′-GTTTCCGTAGGTGAAC CTGC-3′)各1 μL、10×PCR-buffer(含Mg2+)5 μL、dNTPs 4 μL、ExTaqDNA Polymerase 1 μL，模板3 μL、ddH2O补足到50 μL，同时设置阴性对照。PCR扩增反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min， 35个循环，2 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min，最后-20 ℃保存。取5 μL扩增产物加1 μL 6×Loading buffer在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，120 V电泳30～40 min，Gelview染色；在BIO-RAD成像仪紫外光灯下观测并照相。将所得到的有效扩增产物送至上海生工进行双向测序，所得序列经DNAMAN6.0、Chromas分析比对，提交NCBI并下载已知近亲缘种序列，在GenBank注册，用MEGA 5.2中的UPGMA法构建孢囊线虫群体的系统发育树，进行亲缘关系分析。

表1 天祝县五个乡镇燕麦田孢囊线虫发生及分布情况

2 结果与分析

2.1 孢囊线虫的发生分布

由表1可知，80份土样中，35份有孢囊检出，发生率为44%，其中抓喜秀龙乡和安远镇的发生率最高，分别达到了48.4%和54.2%；华藏寺镇的最低，为14.3%。平均孢囊数为4.3个·100 g-1土样，其中空、实孢囊数相近，平均为2和2.3个·100 g-1土样。孢囊的平均卵量为215粒，其中石门镇的最高，为250粒；华藏寺镇的最低，为175粒。由此可见，燕麦田孢囊线虫在甘肃天祝普遍发生，部分乡镇发生严重。

2.2 孢囊线虫的形态特征

2.2.1 孢囊的形态特征

孢囊阔柠檬型，黄褐色至暗褐色，颈部明显(图1)。由表2可知，孢囊的体长为571 μm(447～727 μm)，体宽为449 μm(375～595 μm)，阴门锥为双膜孔型，无下桥，泡状突明显。膜孔长31 μm(28～33 μm)，宽16 μm(13～20 μm)，阴门裂长9 μm(8～11 μm)。

2.2.2 二龄幼虫及卵粒的形态特征

由表3可知，本试验分离的二龄幼虫线形，体长为538 μm(412～604 μm) ，体宽为 25 μm(22～27 μm)；唇区圆，与身体连接处缢缩明显，口针粗壮(图1)，长为22 μm(18～26 μm)；尾部呈锥形，长49 μm(39～69 μm)；有较长的透明区，长31 μm(23～48 μm)；卵呈椭圆型，长121 μm(100～136 μm) ，宽48 μm(41～54 μm)。根据孢囊阴门锥特征及测量值和二龄幼虫的特征及测量值，并与王明祖[23]、陈品三等[24]、Mulvey[25]及Williams等[26]报道的数据相比较，初步将天祝燕麦田采集到的孢囊线虫鉴定为燕麦孢囊线虫(H.avenae)。

2.3 孢囊线虫的分子鉴定结果

每个乡镇各选取2个孢囊，依次编号为HZ1、HZ2、SH1、SH2、DC1、DC2、ZH1、ZH2、 AN1、AN2。进行rDNA-ITS区PCR扩增，均得到长约为1 000 bp的条带，阴性对照无该条带(图2)。将PCR产物经回收、纯化、克隆和测序，得到长度为1 045 bp的ITS序列，将序列提交GenBank并与NBCI下载的ITS序列进行Blast比对，已知序列分别包括Avenae组的有中国(AY148382)、法国(AY148374)、德国(AY148360)、以色列(AY148366)、印度(AF274397)的H.avenae、德国的H.Mani(AY148377)、美国的H.filipjevi(GU079654)、英国的H.arenaria(AF274396)；Schachtii组的有伊朗的H.glycines(AF498387)、比利时的H.schachtii(AY166438)；Goettingiana组的有荷兰的H.cruciferae(AF274411)、意大利的H.carotae(AY347917)、比利时的H.urticae(AF274412)。用MEGA 5.2的UPGMA方法构建ITS区的系统发育树。

聚类分析结果(图3)表明，所有的序列聚为3个大的分支，其中天祝五乡镇的10个禾谷孢囊线虫种群与上述Avenae组的5个群体聚为一个大的分支，Schachtii组的聚为一分支，其置信度为100%；Goettingiana组3个群为一支。在Avenae组的分支中，天祝线虫群体与中国的燕麦孢囊线虫群体聚为一个小的分支，其置信度为98%，其他国家的H.avenae聚在另外一个小的分支中。因此，进一步将天祝燕麦田孢囊线虫鉴定为燕麦孢囊线虫(H.avenae)。

A:浅褐色胞囊；B:受精卵；C卵和二龄幼虫；D、E、F:阴门膜孔和泡状突；G:二龄幼虫头部；H:二龄幼虫尾部；I:二龄幼虫。

A:Cyst; B:Eggs;C:Eggs and second-stage juvenile;D,E,F:Fenestra area and Ballae;G:Head of second-stage juvenile;H:tail of second-stage juvenile; I:second-stage juvenile.

图1 天祝燕麦田孢囊线虫的形态特征

Fig.1 Illustration of cyst nematode in oat field from part populations in Tianzhu

表2 燕麦田孢囊线虫的孢囊、阴门锥的形态测量值

表3 燕麦田孢囊线虫的二龄幼虫、受精卵的形态测量值

M:Maker(DL2000)；N：阴性对照；1～10：华藏寺镇1、华藏寺镇2、石门镇1、石门镇2、打柴沟镇1、打柴沟镇2、抓喜秀龙乡1、抓喜秀龙乡2、安远镇1、安远镇2。

M:Marker(DL2000)；N：Negative control;1-10:HZ1,HZ2,SH1,SH2,DC1,DC2,ZH1,ZH2,AN1,AN2.

图2 甘肃天祝农牧区燕麦田孢囊线虫群体rDNA-ITS序列PCR扩增产物

Fig.2 PCR products of rDNA-ITS sequence of cyst nematodes from agricultural and pastoral oat field at Tianzhu of Gansu province

3 讨 论

孢囊线虫病扩散迅速，在我国的分布逐年扩大，严重影响我国粮食产量。甘肃天祝是农牧业的交错混合区域，具有生态多样性和复杂性，燕麦种植面积大，这为孢囊线虫的扩散[27]提供了有利的条件。本研究所调查的天祝5个燕麦主要种植区在不同程度上均有孢囊线虫的发生，其中平均孢囊检出量为4.3个·100 g-1土样，且平均卵量为8.6粒·g-1土样。李秀花等[28]报道孢囊线虫的经济阈值为5个卵·克-1土样，天祝燕麦田孢囊线虫虫源基数超过了这个经济阈值，这势必对天祝农牧区燕麦产量造成严重的影响。孢囊线虫病在天祝发生普遍，可能与该区域燕麦多年连作有关系，李秀花等[29]研究表明燕麦连作后燕麦孢囊线虫的发生呈上升趋势，休闲或轮作一年以上可有效减低土壤中燕麦孢囊线虫的虫口密度。张东升等[30]报道燕麦孢囊线虫适宜低温高湿的环境，具高温滞育的现象。而天祝常年的气温较低，环境阴湿，土壤富含腐殖质，这非常有利于燕麦孢囊线虫的发生。因此，笔者建议在孢囊线虫密度高于经济阈值的地块，依据环境条件、农事操作和品种抗性等因素采取适宜的防治措施。

H.avenae:燕麦孢囊线虫；H.mani:稀少孢囊线虫；H.arenaria:蚤缀孢囊线虫；H.Filipjevi:菲利普孢囊线虫；H.glycines:大豆孢囊线虫；H.schachtii:甜菜孢囊线虫；H.urticae:荨麻孢囊线虫；H.carotae:胡萝卜孢囊线虫；H.cruciferae:十字花科孢囊线虫。横线上数字为置信度(Numbers on the line indicate degree of confidence)。

图3 UPGMA法构建的甘肃天祝农牧区燕麦田孢囊线虫群体及其近缘种的ITS序列系统进化树

Fig.3 Phylogenetic tree of close related species and the tested populations in agricultural and pastoral oats field of the Tianzhu，Gansu province based on rDNA-ITS sequence using UPGMA method

目前，孢囊线虫种类的鉴定主要采用形态和分子相结合鉴定的方法。形态鉴定特征主要有孢囊长宽、色泽、形状，阴门锥形状、膜孔长宽、阴门裂、下桥有无等，二龄幼虫形态的观察及相关形态特征值的测定。通过形态测量值与参考标准的对比可以初步确定到属，但是单个个体经常不能鉴定到种的水平。本研究对采集自甘肃天祝农牧区燕麦田的孢囊进行形态观察，天祝群体均与燕麦孢囊线虫群体相同，阴门锥无下桥，形态测量值和王明祖[23]、陈品三等[24]、Mulveys[25]、Williams等[26]报道的测量值相比较，部分测量值略微偏小。测量值的偏差可能是寄主种类、地域差异及一些环境因子造成的[31]。以孢囊线虫rDNA-ITS区序列构建系统发育树显示，天祝燕麦田孢囊线虫群体均与燕麦孢囊线虫群体在一个大的分支上，且与中国的燕麦孢囊线虫群体处在进化树的同一支。燕麦孢囊线虫国内和国外群体分别处在不同的进化支上，说明燕麦孢囊线虫在中国群体内具有更高的亲缘关系，这与王 瑄等[32]对江苏群体分子特征分析所得到的结论一致。系统发育树中，中国的燕麦孢囊线虫与印度的、德国的、英国的及美国的燕麦孢囊线虫处于不同的分支，说明中国群体与印度群体和欧洲群体有差异性，这与Zheng等[33]对山西太谷群体的分子特征研究结果相一致。与传统的形态鉴定相比，分子生物学鉴定更快捷、简单，但有研究表明燕麦孢囊线虫rDNA-ITS区有异质性，不同群体间ITS序列存在变异[34]，因此形态学鉴定对于植物线虫的鉴定不可替代，分子鉴定可作为辅助工具，提高鉴定的准确度。

本次调查只是针对天祝主要农牧区，而对于其他不同区域和不同作物是否有孢囊线虫的侵染，不同线虫群体之间有没有致病性的差异还需做进一步研究。

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Investigation and Identification of Cyst Nematode in Agricultural and Pastoral Oats Fields in Tianzhu of Gansu Province

LI Jianrong1,ZHAO Peng1,XU Penggang1,JIAN Jinzhuo1,PENG Deliang2,LI Huixia1

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education/Sino-U.S. Centers for Grazing Land Ecosystem Sustainability,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pest/Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

In order to define the occurrence and distribution of oat cyst nematode in agricultural and pastoral areas of Tianzhu of Gansu,investigations were carried out from August to September in 2014,based on methods of Z type. The results showed that the incidence of cyst nematode was 44% in the 80 soil samples with 4.3 cysts per 100 g soil sample. The highest incidence of cyst nematodes was 54.2%,appearing in Anyuan town. The lowest incidence of cyst was 14.3%,appearing in Huazansi town. The cysts were light brown and large lemon-shaped,with the average length of 571 μm(447-727 μm) and average width of 449 μm(375-595 μm). The vulva cones were double Fenestra area,with the length of 31 μm(28-33 μm) and the width of 16 μm(13-20 μm),and the length of vulval slit was 9 μm(8-11 μm). There was obvious bullaeno without under-bridge in vulva. The fragments of rDNA-ITS from five counties in Tianzhu were all 1 045 bp length. The similarities between these groups andHeteroderaavenaewere 99%-100% by alignment blasting on Gene Bank.The phylogenetic tree revealed that the Tianzhu populations were grouped with domestic and abroad populations ofH.avenaeinto a branch and Tianzhu populations were grouped with China populations ofH.avenae. Thus,the nematodes collected from oats in Tianzhu were identified asH.avenae.

Tianzhu; Pastoral areas; Oat; Cyst nematode

时间：2016-07-07

2016-02-28

2016-03-08

国家公益性行业(农业)科研专项(201503114)；国家自然科学基金项目(31460463)

E-mail：1072285812@qq.com

李惠霞(E-mail:lihx@gsau.edu.cn)

S512.6；S433

A

1009-1041(2016)07-0961-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1531.038.html