谢昌良， 王朝晖， 王文婷， 陈佳卓， 张宇宁， 郑虎， 柏瑶苹

(1. 暨南大学 生命科学技术学院， 广东 广州 510632； 2. 惠州市海洋与渔业局大亚湾经济技术开发区分局， 广东 惠州 516081)

甲藻是海洋生态系统中重要的浮游植物类群，其种类和数量仅次于硅藻，也是有毒有害赤潮的重要原因种。许多甲藻在其生活史的某个阶段能形成体眠孢囊，当外部环境条件恶劣时，甲藻细胞壁增厚形成甲藻孢囊，并随其他碎屑物质沉入海底，当外部环境适宜时，甲藻重新以营养细胞的形式进入水体进行生命活动[1-2]。常见的近岸海域循环发生赤潮的物种许多为可形成孢囊的种类，沉积物中孢囊萌发亦成为翌年赤潮发生的种源。由于浮游植物有较厚的耐受性孢囊壁，在外部条件稳定的情况下存活时间可达数十年、甚至上百年[3]。因此沉积物中孢囊的密度以及百分比含量可以反映当时海域浮游植物状况以及赤潮发生历史，也可揭示水体营养细胞种群动态和未来赤潮的发生潜势。

象山港是多种鱼虾贝藻等海洋生物栖息、生长繁殖和育肥的优良场所，是浙江省最大的水产养殖基地，同时也具有海洋旅游及湿地保护的重要作用。近年来，随着沿岸地区工农业发展及人类活动影响，象山港海域富营养化问题显著，养殖区水质已经呈现出劣Ⅳ类水质[4-5]。象山港水域赤潮最早记录出现在1973年，近年来象山港海域赤潮发生面积不断扩大，频率不断增加，主要赤潮种类包括中肋骨条藻、角毛藻等硅藻赤潮，甲藻赤潮也时有发生[4]。孢囊被认为是赤潮发生的“种源”[2]，但是目前有关象山港沉积物中甲藻孢囊的报道并不多见，对于有毒有害甲藻的孢囊的关注更是少有。为了了解象山港甲藻孢囊的分布状况，揭示有毒有害甲藻赤潮发生潜势，本研究采集了象山港表层沉积物样品，对沉积物中甲藻孢囊的分布规律进行研究，重点阐明有毒有害甲藻孢囊的分布；同时测定了沉积物中生源要素含量，分析孢囊分布与生源要素的关系，以期为象山港的环境保护和海洋资源可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醛溶液(37%)、氢氧化钠(NaOH，上海麦克林)、过硫酸钾(K2S2O8，上海麦克林)、钼酸铵[(NH4)2MoO4，上海麦克林]、酒石酸氧锑钾(C8H4K2O12Sb2，上海麦克林)、抗坏血酸(C6H8O6，上海迈瑞尔)、对甲氨基酚硫酸盐(C7H9NO·1/2H2SO4，上海麦克林)、亚硫酸钠(Na2SO3，上海麦克林)。

彼得逊抓斗式采泥器、元素分析仪(Perkin-Elmer 2400 Series Ⅱ，美国)、置于倒置显微镜(Nikon ECLIPSE，日本)、紫外可见分光光度计(Yoke Instrument-N5000，中国)、电热恒温箱(BJYSL-DHG-9030A，中国)、不锈钢筛网。

1.2 采样区与采样方法

象山港，位于浙江省宁波市东南部，地处N29°24′～29°46′和E121°25′～122°00′的范围内，是一个由东北向西南深入内陆的狭长型半封闭海湾，全港纵深60 km，一般水深10～15 m。在象山港海域设置了7个采样点(图1)，于2016年7月用彼得逊抓斗式采样器采集了表层沉积物样品。由于表层0～2 cm的沉积物为最近1～2年的沉降物形成[6]，因此采集0～2 cm深度的沉积物样品，混匀后用聚乙烯取样袋密封，低温黑暗保存，运送至实验室后-20 ℃避光保存待测。

图1 象山港孢囊研究采样图

1.3 生源要素的测定

使用电热恒温箱对沉积物样品进行前处理,45 ℃烘干至恒重，研磨后过100目筛网，放入自封袋中保存用于后续测定。总氮(total nitrogen, TN)和总有机碳(total organic carbon, TOC)质量分数采用元素分析仪测定[7]，总磷(total phosphorus, TP)质量分数采用过硫酸盐同步消化法检测[8]，生物硅(bio-silicon, Bsi)采用化学连续提取法提取[9]。生源要素测定过程中的质控评估参考《近海海洋沉积物》(GBW 07314，中国)中空白试剂和10个重复的标准沉积物样品的分析测定，各指标的测定误差均在5%以内。

1.4 孢囊的分析与鉴定

将5 g湿沉积物与适量过滤海水混合均匀后，水浴超声处理60 s，然后过孔径为120目(125 μm)的筛网，收集滤过物过1250目(10 μm)的筛网，最后收集1600目筛网上的颗粒物，定容至10 mL，加入体积浓度为3%的福尔马林固定剂。依据固定样品的干净程度，吸取0.1～1 mL处理后的样品及适量过滤海水于计数框中，充分混匀扩展至整个计数框，置于倒置显微镜下进行孢囊形态鉴定和数量统计。对孢囊进行定性定量分析，要求每个样品观察分析至少100 个孢囊，以每克干沉积物中甲藻孢囊数量表示孢囊密度(cysts/g D Wt)[1,6]。

1.5 数据处理与统计分析

采用EXCEL 2019对孢囊数据整理分析，并绘制孢囊多样性折线图及不同孢囊百分比柱状图。基于孢囊密度数据，使用R语言(Version 4.0.2)vegan包(Version 2.5.6)计算α多样性指数，包括香农-威纳多样性指数(Shannon-Wiener diversity index，H′)和皮卢均匀度指数(Pielou’s evenness index，J)。基于皮尔森相关系数，利用R语言(Version 4.0.2)psych包(Version 0.9.2)计算孢囊与生源要素的相关关系，使用corrplot包(Version 0.89)将结果可视化。使用软件ArcMap 10.2绘制采样图及孢囊密度的地理分布图，孢囊密度的地理分布图采用反距离权重插值法构建。基于每种孢囊的平均密度确定其优势度，使用R语言(Version 4.0.2)ggplot2(Version 3.3.5)和reshape2(Version 1.4.4)函数包绘制气泡图可视化优势孢囊的分布。

2 结果与分析

2.1 甲藻孢囊集群结构

在象山港海域表层沉积物中，共分析鉴定出甲藻孢囊26种，其中膝沟藻目9种、Thoracosphaerales目2种(斯氏藻孢囊)、Suessiales目1种(别什藻孢囊)、裸甲藻目6种、多甲藻类目7种以及未确定至目(Dinophyceae incertae sedis)的1种(环胺藻，Azadiniumsp.)。每个站位所鉴定到的孢囊种类相近，为17～21种(表1)。本研究分析鉴定出10种有毒有害甲藻的孢囊，包括麻痹性贝类毒素(PSP)原因种奥氏亚历山大藻(Alexandriumostenfeldii)和链状/塔玛亚历山大藻(Alexandriumcatenella/tamarense)孢囊复合体，虾夷扇贝毒素(YTX)原因种具刺膝沟藻(Gonyaulaxspinifera)、多边舌甲藻(Lingulodiniumpolyedra)和网状原角藻(Protoceratiumreticulatum)，环胺藻毒素(AZP)潜在原因种环胺藻, 产生鱼毒素的哈曼多沟藻(Polykrikoshartmannii)以及赤潮藻类Barrufetabravensis、锥状斯氏藻(Scrippsiellaacuminata)和垂裂莱万藻(Levanderinafissa)；其中哈曼多沟藻、具刺膝沟藻、Barrufetabravensis、环胺藻和多边舌甲藻在每个站位均有分布(表1，图2)。H′偏低，为1.92～2.17；J则为0.68～0.74(图3A)。

图2显示了26种甲藻孢囊按照优势度排列的分布状况，9种孢囊在所有站位均有分布，除了5种有毒有害赤潮种类的孢囊外，另有4种孢囊在所有站位分布，分别为五角原多甲藻(Protoperidiniumpentagonum)、安倍原多甲藻(Protoperidiniumabei)、里昂原多甲藻(Protoperidiniumleonis)和长膝沟藻(Gonyaulaxelongata)。密度最高的为3种原多甲藻孢囊，平均孢囊密度为10.8～35.4 cysts/g D Wt；其次是别什藻(Biecheleriatirezensis)孢囊，平均孢囊密度为4.5 cysts/g D Wt，而其他孢囊密度均较低。

图2 甲藻孢囊按优势度排列的分布

甲藻具有自养型及异养型营养方式，象山港沉积物中共分析鉴定出18种自养型甲藻孢囊和8种异养型甲藻孢囊(表1)，异养型甲藻孢囊包括7种原多甲藻属的孢囊以及裸甲藻目中的无纹多沟藻(Polykrikosschwartzii)孢囊。象山港表层沉积物中异养型甲藻孢囊占据优势(图3B)，各站位异养型甲藻孢囊密度占比为67.6%～81.0%，平均达到72.6%。在各类孢囊中，以多甲藻目的孢囊占据优势，全部为异养型的原多甲藻属的孢囊，占比为67.6%～80.0%，平均为72.2%。膝沟藻目和裸甲藻目孢囊次之，平均占比分别为11.5%和6.5%，其他类别的孢囊密度较低，占比均低于5%(图3C)。

表1 象山港海域表层沉积物中甲藻孢囊信息及分布状况

(续上表)

A：香农-威尔种类多样性指数(H′)和皮卢均匀度指数(J)，B: 自养型和异养型甲藻孢囊百分比组成，C: 不同目的甲藻孢囊百分比组成

2.2 甲藻孢囊密度的地理分布

象山港海域甲藻孢囊及优势目的孢囊的地理分布见图4，总孢囊密度和各类孢囊密度分布规律相近，均呈现出港中大于港顶和港口的趋势，高值区位于XS5，而在位于港顶的XS1-XS4较低。孢囊密度介于69.8～174.4 cysts/g D Wt，平均为100.2 cysts/g D Wt，最高值位于XS5，XS6次之，其余站位的孢囊密度均小于100 cysts/g D Wt，最低值位于XS2(图4A)。膝沟藻目孢囊的密度介于4.2～20.3 cysts/g D Wt，平均密度为11.6 cysts/g D Wt，最低值位于XS3，最高值位于XS5(图4B)。裸甲藻目孢囊的密度介于7.6～26.5 cysts/g D Wt，平均密度为7.6 cysts/g D Wt，最低值位于XS1，最高值位于XS5(图4C)。多甲藻目孢囊的密度介于49.8～119.9 cysts/g D Wt，平均密度为71.9 cysts/g D Wt，其分布规律与总孢囊密度相似，呈现出港中大于港顶和港口的趋势，最高值位于XS5，最低值位于XS4(图4D)。

A：总孢囊，B：膝沟藻目孢囊，C：裸甲藻目孢囊，D：多甲藻目孢囊

2.3 甲藻孢囊与生源要素之间的关系

图5展示了象山港表层沉积物中甲藻孢囊与生源要素的皮尔森相关性分析可视化结果，孢囊密度以及主要类别孢囊密度均与BSi呈现出明显的正相关关系(P<0.05或P<0.01)，Thoracosphaerales的孢囊密度(2种斯氏藻孢囊)与TOC明显正相关(P<0.05)，Suessiales的孢囊密度与TP明显负相关(P<0.05)，环胺藻孢囊密度与TP明显正相关(P<0.01)。孢囊种类数与总孢囊密度及膝沟藻、裸甲藻和多甲藻等优势目孢囊密度均呈明显正相关关系(P<0.05或P<0.01)，而总孢囊密度也与优势目孢囊密度呈明显正相关关系(P<0.05或P<0.01)。

*P<0.05; **P<0.01; Thor、Sues分别表示Thoracosphaerales和Suessiales的孢囊密度

3 讨论

本研究在浙江省象山港7个站点的表层沉积物中共发现甲藻孢囊26种，每个站位鉴定的孢囊种类数为17～21种。孢囊的种类多样性与我国及世界其他海域沉积物中的甲藻孢囊种类丰富度相近，在我国其他海域表层沉积物中甲藻孢囊种类一般为20～40种[10-12]。休眠孢囊是很多甲藻类群生活史的特殊休眠阶段，约有10%～20%的甲藻在休眠阶段能够形成休眠孢囊，包括许多有害赤潮藻类也能产生休眠孢囊[1]，而大部分可以形成孢囊的甲藻种类为近岸海域循环发生赤潮的藻类[1]。但是目前许多休眠孢囊的形态特征尚未被完全识别，一些孢囊与营养细胞的对应关系还依然未明晰[13]。因此，通过显微镜观察到的休眠孢囊种类多样性和密度往往并不能真实的反映出自然状态下的情况。尽管如此，通过传统的形态学分类对孢囊集群进行分析鉴定，依然是沉积物中孢囊研究的基础。

象山港海域各站点甲藻孢囊密度介于69.8～174.4 cysts/g D Wt，孢囊密度虽然小于胶州湾[14]、北黄海[15]、辽东半岛[16]以及广东大亚湾[17]和深圳湾[18]等，但相比其他近岸海域及河口地区如渤海湾[12]、长江口海域[11]、珠江口[13]以及福建兴化湾[19]等略高。甲藻孢囊通常较易在颗粒大小、沉降性质与之相近的粘土中积累，一般沉积物粒径越小的粘性沉积物中甲藻孢囊密度较高[20]。同时孢囊密度与沉积物的沉降速率有关，沉降速率越高，单位时间内形成的孢囊就会被稀释，因此孢囊密度也较低。象山港沉积物多由粉砂粒径的颗粒物组成，粉砂颗粒物占78%～90%[21]，粗糙的沉积物不利于孢囊的沉积。此外，象山港是一个半封闭性内湾，也是浙江省的重要养殖基地，受人为活动干扰大，沉积速率较高[21]，导致沉积物中孢囊密度降低。传统显微镜鉴定受人为影响较大，个体较小的孢囊以及形态学特征不明显的孢囊可能被忽略，而孢囊上覆盖的杂质也可能遮盖孢囊特征，无法准确鉴定而被忽略，导致鉴定到的孢囊类型和密度的减少。

甲藻孢囊密度占比最高的为原多甲藻孢囊，平均达到72.3%。原多甲藻是最为常见的异养型甲藻，需要摄食水体中硅藻等小型浮游植物[22]。一般来说，自养型甲藻的生物量及生长速度应高于作为消费者的异养型甲藻。因此，沉积物中自养型孢囊产量应高于异养型孢囊。当异养型甲藻孢囊百分比含量上升，说明其摄食的小型硅藻生物量高，在浮游植物群落中占优势，而小型硅藻的大量繁殖说明了富营养化程度的增加[22-23]。因此，较高的异养型孢囊百分比可用来指示水体较高的富营养化程度和初级生产力，如日本东京湾[23]、韩国南部沿海[24]、我国长江口[25]、广东沿海等[13]。象山港表层沉积物中异养型甲藻孢囊占比较高，在一定程度上说明了水体中较高的初级生产力及富营养化水平。研究表明近年来象山港富营养化趋势明显[5]，硅藻为浮游植物主要类群，硅藻赤潮也时有发生[26-27]。BSi主要是硅藻死亡沉降形成，BSi含量可反映水体中硅藻生物量的高低。本研究中孢囊密度以及主要类别孢囊密度均与BSi呈现出明显的正相关关系，说明硅藻生物量是决定孢囊生产力的重要因素。从孢囊密度的地理分布来看，孢囊峰值区位于港中的XS5站点，而在港顶区孢囊密度较低。吴燕妮等[5]分析了2007～2015年象山港海域的水质变化情况，也发现港中海域富营养化程度要高于港顶。由此可见港中海域丰富的营养盐孕育了大量小型硅藻，从而导致了原多甲藻孢囊及总孢囊密度的上升。

象山港沉积物中有毒有害甲藻孢囊丰富，共鉴定出有毒有害赤潮甲藻孢囊10种，其中具刺膝沟藻、多纹舌甲藻和网状原角藻能产生虾夷扇贝毒素(YTX)[28]，而且具刺膝沟藻和多纹舌甲藻在所有站位均有分布。贝类可通过滤食有毒藻细胞将YTX在体内累积转化并沿食物链传递，对贝类消费者、人类健康及生命安全造成了潜在的威胁。虽然我国目前尚无YTX毒素原因种的赤潮，但是这些藻类的孢囊在沉积物中普遍分布[10,15]，YTX类毒素也不时在浮游植物样品和贝类样品中检出[29]。

亚历山大藻是麻痹性贝类毒素(PSP)原因种，亚历山大藻在我国沿海发生了多起赤潮[30]，同时亚历山大藻的孢囊也广泛分布在我国沿海沉积物中[10]；PSP毒素在浮游植物和贝类样品中广泛检出[31-32]，而且大亚湾海域亚历山大藻孢囊被认为是贝类体内PSP毒素的重要来源[33]。本研究鉴定出两种亚历山大藻孢囊，在5个站位检出，分布较为广泛但密度较低，最高值仅为6.3 cysts/g D Wt。其他有毒有害甲藻或者赤潮原因种如环胺藻、哈曼多沟藻和Barrufetabravensis等的孢囊在所有站位均有分布，密度均较低。但研究发现稀有类群也可以作为季节性演替或赤潮的种源[34]。虽然象山港尚未有这些赤潮的发生，但有毒有害甲藻孢囊种类丰富，分布广泛，具有赤潮发生的潜在风险，值得引起关注。

作者贡献声明

谢昌良：统计分析数据，修改论文；王朝晖：提出研究思路和框架，撰写论文；王文婷：样品采集，实验操作；陈佳卓：论文修改；张宇宁：文献资料查证；郑虎：文献整理及部分论文修改；柏瑶苹：技术支持，文章审阅定稿。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突。