朱 娉，冯 波，徐智斌，樊小莉，王 涛

(1.中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041； 2.中国科学院大学，北京100049)



小麦籽粒蛋白含量相关基因NAM新等位变异的挖掘

朱 娉1,2，冯 波1，徐智斌1，樊小莉1，王 涛1

(1.中国科学院成都生物研究所，四川成都 610041； 2.中国科学院大学，北京100049)

NAM基因是NAC基因家族的成员之一，该基因能加速植株叶片衰老，增加籽粒蛋白质积累，并促进锌、铁等微量元素吸收。为选育高蛋白和高微量元素含量的小麦品种，用NAM共显性标记Xuhw89对858份小麦材料进行了筛选，并进一步扩增全长序列。结果表明，有3个栽培二粒小麦含有功能性NAM基因，其中，F37与F40来源的NAM基因分别与已公布的 TaNAC2基因和 TtNAM-A1基因(GenBank登录号分别为HQ872050和DQ869672)相同；F34来源的NAM基因(命名为TdNAM，GenBank登录号为KU529317)与已公布的 TtNAM-B2基因(GenBank登录号为DQ869676)相似度最高，共有5处核苷酸差异，1处发生在内含子，另外4处发生在外显子区，导致了3个氨基酸残基的变化，预测分析发现这种差异不会对蛋白功能产生影响。因此，本研究筛选获得的NAM基因新等位变异可为进一步选育高蛋白、高微量元素含量的小麦品种提供材料和基因资源。

小麦；NAM基因；新等位变异；分子标记；序列分析

谷物是人类摄取蛋白质和微量元素的主要来源。世界卫生组织报告显示，超过20亿的人口缺乏锌、铁等主要微量元素，超过1/3的世界人口处于蛋白质缺乏的亚健康状态[1-2]。小麦作为世界主要的粮食作物之一，提高其蛋白质及锌、铁等微量元素含量对改善人类健康至关重要。

前人的研究表明，控制籽粒蛋白质含量(Grain protein contents,GPC)的数量性状位点 Gpc-B1位于野生二粒小麦(Triticumturgidumvar.dicoccoides)6BS染色体上，该位点具有多效性，在开花期，增加可溶性蛋白和氨基酸在旗叶中的积累，提高氮同化效率，并最终影响籽粒大小与蛋白质含量[3]。Uauy等[4]进一步将 Gpc-B1位点上控制籽粒蛋白质含量的关键基因图位克隆，命名为 NAM-B1，并采用RNA干扰技术降低 NAM-B1基因表达水平，植株衰老时间延迟3周，籽粒中的蛋白质、锌、铁元素含量下降30%。然而，六倍体小麦中 Gpc-B1位点上的 NAM-B1基因中1个碱基的插入导致移码框突变，NAC结构域丢失，蛋白无功能，籽粒蛋白及锌、铁微量元素含量明显偏低[4]。因此，筛选具有功能性NAM基因的材料是小麦品质改良的另一途径。

NAM转录因子是NAC转录因子家族成员之一。此类转录蛋白的N端为高度保守的NAC结构域(含A、B、C、D和E五个亚基)，含有蛋白质和DNA结合位点；C端为转录激活域，具有高度多样性[5-8]。Jamar等[9]发现不同大麦品种的 HvNAM-1多态性明显，其编码蛋白的C亚基中脯氨酸代替丙氨酸可能影响蛋白质构像或转录过程中的DNA结合能力[10]，结合籽粒蛋白含量的测定发现，新等位变异的品种籽粒蛋白含量偏高。Wang等[11]在大麦中发现HvNAM- 1基因编码区544位碱基的变异(脯氨酸→丙氨酸)，造成籽粒蛋白含量降低。可见，NAM基因的多态性会影响籽粒性状。然而，目前小麦中还没有报道影响籽粒蛋白质含量的NAM等位变异。

Mesfin等[12]和Khan等[13]将野生二粒小麦 Gpc-B1基因转化进入面包小麦中，获得了Glupro稳定高蛋白品种。随后，Khan等[13]开发出限制性长度多态性标记用于筛选 Gpc-B1位点，然而这些标记的PCR产物需要酶切处理才能判断基因型。Distelfeld等[14]开发的共显性标记Xuhw89为特异性标记，可直接检测到低蛋白含量的四倍体硬粒小麦LDN和高蛋白含量的野生二粒小麦DIC的 Gpc-B1位点中4 bp大小的差异，从而高效筛选出功能性NAM基因。因此，本研究利用标记Xuhw89对858份小麦材料进行筛选，以期检测含有 Gpc-B1位点的籽粒高蛋白含量品种，并通过同源克隆获得NAM基因，以期获得新的等位变异，为进一步培育高蛋白和高微量元素的小麦新品种提供种质材料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用材料包括含 Gpc-B1基因的高蛋白小麦品种Glupro(阳性对照)、LDN(阴性对照)及供试的858份小麦材料(人工六倍体小麦345份、四倍体小麦100份、中国小麦微核心种质222份及地方品种小麦191份)。Glupro由美国农业部提供，人工六倍体材料由SIMMTY提供，四倍体由中国科学院遗传与发育生物学研究所王道文课题组提供，微核心种质由中国农业科学院贾继增课题组提供，地方品种来自本实验室。

2×TaqPCR MasterMix和DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京)；KOD-Plus-Neo高保真酶、10×Buffer、dNTPs和MgSO4均购自TaKaRa公司(大连)；pEASY-Blunt Cloning kit、Trans-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；引物由成都擎科梓熙生物有限公司合成。

1.2 Xuhw89标记的检测

采用CTAB方法提取基因组DNA[19]。利用共显性标记Xuhw89[14](F:5′-TCTCCAAG AGGGGAGAGACA-3′; R:5′-TTCCTCTCCC ATGAATCTAGCA-3′)对阳性对照、阴性对照及供试的858份小麦材料DNA进行PCR扩增。扩增体系(10 μL)：2×TaqPCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.1 μL，DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL，加ddH2O至10 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显影，拍照分析。

1.3 NAM基因的同源克隆

以1.2中筛选到的与阳性对照Glupro扩增到的片段大小一致的材料DNA为模板，采用用于扩增山羊草NAM基因的引物P1/P2[5](P1：5′-AGATCTGATGAGGTCCATGGG-3′；P2：5′-ATGCCCGTATGTGGTGTTCATAT-3′)进行NAM基因全长扩增。扩增体系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，2 mmol·L-1dNTPs 2 μL，25 mmol·L-1MgSO41 μL，上下游引物各0.2 μL，KOD-plus-Neo酶0.4 μL，100 ng·μL-1模板DNA 1 μL，加ddH2O至20 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性40 s，55.3 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 20 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的片段回收后克隆，每个样品3次重复，最后交由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行DNA测序。

1.4 NAM基因的生物信息学分析

用DNAMAN进行序列比对分析；用BLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)检索同源序列；用New GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行预测分析基因结构及氨基酸组成；用NCBI的CD-search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行结构域预测；用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/) 预测蛋白功能位点。

2 结果与分析

2.1 Xuhw89标记的检测结果

利用共显性分子标记Xuhw89对供试的858份小麦材料进行筛选，结果(图1)表明，有3个栽培二粒小麦材料F34、F37和F40的扩增带型与Glupro一致，获得大小为122 bp的扩增条带，其余材料带型与LDN一致，获得大小为126 bp的扩增条带。

2.2 3个二粒小麦NAM基因的克隆及其核酸序列分析

利用引物P1/P2对3个栽培二粒小麦材料 F34、F37和F40的基因组DNA进行PCR扩增，得到大小约1.5 kb的扩增产物(图2)。测序后分析发现，这3个材料的NAM基因序列均含有一个完整的开放阅读框。NCBI在线BLASTn表明，F37来源的NAM基因序列与已公布的 TaNAC2基因序列(GenBank登录号为HQ872050)一致；F40来源的NAM基因序列与已公布的 TtNAM-A1基因序列(GenBank登录号为DQ869672)一致；F34来源的NAM基因序列与已公布的 TtNAM-B2基因序列(GenBank登录号为DQ869676)相似度最高。因此，推测F34来源的NAM基因序列为小麦NAM基因的一个新等位变异类型，将其暂命名TdNAM，同时将其提交至GenBank，得到序列登录号为KU529317。

M:pUC18 DNA/MspⅠ Marker; G:Glupro; 1:F34; 2:F37; 3:F40; L:LDN; 4:F38; 5:F42; 6:S64; 7:S81; 8:h45.

图1 标记Xuhw89扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

Fig.1 Polyacrylamide gel of the amplified

products of molecular marker Xuhw89

进一步对TdNAM基因核酸序列进行分析发现，TdNAM基因序列包括3个外显子和2个内含子。与其相似度最高的 TtNAM-B2基因序列相比发现，TdNAM基因核酸序列共有5处核苷酸变异，其中，1处发生在第一个内含子第311位(C→T)；另外4处发生在外显子区，分别为第一个外显子第181位(A→G)及第三个外显子第897位(C→G)、第1 027位(G→A)和第1 322位(G→C)(图3)。

M:DL5000 DNA Marker; G:Glupro; 1:F34; 2:F37; 3:F40.

图3 TtNAM-B2基因与 TdNAM基因的结构比对图

A～E:NAM亚结构域；△表示蛋白结合位点；*表示核苷酸结合位点。

A-E:NAM sub-domains; △ indicates the protein-binding region; * indicates the polynucleotide-binding region.

图4NAM基因编码氨基酸序列的比对分析图

Fig.4 Sequence analysis ofNAMtranscription factors

2.3 推导的蛋白质序列分析

TaNAC2基因和 TtNAM-A1基因编码405个氨基酸残基，TdNAM基因编码396个氨基酸残基。通过序列比对分析发现，其蛋白序列的N端均有一个典型的NAC结构域，A、B、C、D和E五个亚基高度保守；C端为转录激活域。野生二粒小麦中的NAM等位基因在功能区域均高度保守，以 TtNAM-B2(GenBank登录号为ABI94355)作为参考序列，TdNAM有3处氨基酸残基差异，包括位于B亚基的第61位(Thr→Ala)及位于TAR结构域的第197位(Ala→Gly)和第339位(Gly→Arg)。通过PredictProtein软件分析发现，本研究获得的TdNAM基因编码的氨基酸残基变异没有发生在转录因子的核酸结合位点及蛋白结合位点，且通过SNAP2预测，该3个碱基差异不会对蛋白功能产生影响。

3 讨 论

NAM转录因子作为NAC家族成员，能调控植物的生长及籽粒品质性状。野生型 NAM-B1在栽培条件下容易发生突变，因此培育品种中含有功能性的 NAM-B1基因较少[15]。Asplund等[20]在63份瑞典小麦中仅筛选到4份六倍体材料含有野生型 NAM-B1。Hagenblad等[15]利用SSR标记从367份来自世界各地的面包小麦品种中仅筛选到5份小麦材料(4份春小麦和1份冬小麦)含有野生型 NAM-B1基因。Hu等[16]研究表明，能扩增出Xuhw89特征条带的小麦材料籽粒蛋白含量明显高于其他品种。本研究通过共显性标记Xuhw89在858份小麦材料中筛选，得到3个栽培二粒小麦含有控制籽粒高蛋白含量的NAM基因，可作为籽粒高蛋白含量候选材料进一步研究。

Ooka等[6]发现NAC转录因子的A、C和D亚基高度保守，与转录因子结合核苷酸或蛋白质相关； B、E亚基则与生长发育或组织特异表达相关。本研究获得的3个NAM基因均含有3个外显子和2个内含子，与山羊草中NAM基因结构一致[5]。通过氨基酸序列分析发现，3个NAM转录因子N端均含有一个NAC结构域，保守性较高；C端为激活结构域，多态性较明显。TdNAM基因与已公布的 TtNAM-B2基因同源性最高，其编码蛋白仅有3处氨基酸差异，B亚基中精氨酸代替苏氨酸，其A、C和D亚基保守，可能影响植物生长。在蛋白序列中丙氨酸的替换容易影响蛋白质构像，大麦中HvNAM1、HvNAM2在102位丙氨酸到脯氨酸的差异，其籽粒蛋白含量上升[17]，本实验获得的TdNAM也有丙氨酸的替换现象，可能影响蛋白结构。史红飞等[18]克隆得到的 TaNAC2基因编码的蛋白预测定位于细胞核中，可能调节籽粒性状。Uauy等[4]克隆得到的 TtNAM-B1、 TtNAM-B2、 TtNAM-A1位于染色体不同的位置，三者表达模式相近，均能不同程度地促进籽粒中蛋白和锌、铁等微量元素的积累。通过PredictProtein预测发现，TdNAM与TtNAM-B2在功能位点无差异，TdNAM应具有促进籽粒蛋白含量积累的功能。下一步将通过构建遗传群体来验证其在提高籽粒中蛋白含量及Zn、Fe等微量元素含量方面的功能。

本研究从858份小麦材料中筛选获得3份含有功能性NAM基因的栽培二粒小麦，其中1个为新等位变异，为下一步选育高蛋白、微量元素含量的小麦品种提供材料和基因资源。

[1]SHEWRY P R.Improving the protein content and composition of cereal grain [J].JournalofCerealScience,2007,46(3):239-250.

[2]WHO.The World Health Report:Reducing risks and promoting healthy life [R].Geneva,Switzerland:World Health Organization,2001.

[3]JOPPA L R,DU C,HART G E,etal.Mapping gene(s) for grain protein in tetraploid wheat(TriticumturgidumL.) using a population of recombinant inbred chromosome lines [J].CropScience,1997,37:1586-1589.

[4]UAUY C,DISTELFELD A,FAHIMA T,etal.ANACgene regulating senescence improves grain protein,zinc,and iron content in wheat [J].Science,2006,314:1298-1301.

[5]HU X G,WU B H,YAN Z H,etal.Characteristics and polymorphism ofNAMgene fromAegilopssectionSitopsisspecies [J].AfricanJournalofAgriculturalResearch,2012,7(37):1586-1589.

[6]OOKA H,SATOH K,DOI K,etal.Comprehensive analysis of NAC family genes inOryzasativaandArabidopsisthaliana[J].DNAResearch,2003,10:239-247.

[7]ERNST H A,OLSEN A N,SKRIVER K,etal.Structure of the conserved domain of ANAC,a member of the NAC family of transcription factors [J].EMBORepoters,2004,5(3):297-303.

[8]OLSEN A N,ERNST H A,LEGGIO L L,etal.NAC transcription factors:structurally distinct,functionally diverse [J].TRENDSinPlantScience,2005,10(2):1360-1385.

[9]JAMAR C,LOFFET F,FRETTINGER P,etal.NAM- 1 gene polymorphism and grain protein content inHordeum[J].JournalofPlantPhysiolgy,2010,167(6):497-501.

[10]XUE G P,BOWER N I,MCINTYRE C L,etal.TaNAC69 from the NAC superfamily of transcription factors is up-regulated by abiotic stresses in wheat and recognises two consensus DNA-binding sequences [J].FunctionalPlantBiology,2005,33(1):43-57.

[11]WANG Y G,REN X F,SUN D F,etal.Origin of worldwide cultivated barley revealed byNAM- 1 gene and grain protein content [J].FrontPlantScience,2015,6:1-12.

[12]MESFIN A,FROHBERG R C,KHAN K,etal.Increased grain protein content and its association with agronomic and end-use quality in two hard red spring wheat populations derived fromTriticumtugidumL.var.dicoccoides[J].Euphytica,2000,116:237-242.

[13]KHAN K,FROHBERG R,OLSEN T,etal.Inheritance of gluten protein components of high protein hard red spring wheat lines derived fromTriticumturgidumvar.dicoccoides[J].CerealChemistry,1989,166:397-401.

[14]DISTELFELD A,UAUY C,FAHIMA T,etal.Physical map of the wheat high-grain protein content gene Gpc-B1 and development of a high-throughput molecular marker [J].NewPhytologist,2006,168:753-763.

[15]HAGENBLAD J,ASPLUND L,BSLFOURIER F,etal.Strong presence of the high grain protein content allele of NAM-B1 in Fennoscandian wheat [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2012,125(8):1677-1686.

[16]胡 云,徐如宏.小麦高蛋白质含量基因 Gpc-B1的分子标记研究[J].天津农业科学,2014,20(9):6-10.

HU Y,XU R H.Markers linked to high protein content genes Gpc-B1 in wheats [J].TianjinAgriculturalSciences,2014,20(9):6-10.

[17]CAI S G,YU G,CHEN X H,etal.Grain protein content variation and its association analysis in barley [J].BMCPlantBiology,2013,13(35):1-11.

[18]史红飞,高 翔,陈其皎,等.小麦NAC转录因子的基因克隆与序列分析[J].麦类作物学报,2011,31(3):395-401.

SHI H F,GAO X,CHEN Q J,etal.Genes cloning and sequences analysis of NAC transcripter factor in wheat[J].JournalofTriticeaeCrops,2011,31(3):395-401.

[19]ROGERS S O,BENDICH A J.Extraction of DNA from milligram amounts pf fresh,herbarium and mummified plant tissues [J].PlantMolecularBiology,1985,5:69-76.

[20]ASPLUNDA L,HAGENBLADA J,LEINO M W.Re-evaluating the history of the wheat domestication gene NAM-B1 using historical plant material [J].JournalofArchaeologicalScience,2010,37(9):2303-2307.

Exploring New Alleles ofNAMGene Related with Grain Protein Content in Wheat

ZHU Ping1,2,FENG Bo1,XU Zhibin1,FAN Xiaoli1,WANG Tao1

(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Science,Chengdu,Sichuan 610041,China;2.University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China)

NAMgene is a member of the NAC family.It can accelerate leaf senescence,and increase the protein remobilization to grains and promote absorption of zinc,iron and other trace elements.To select the excellent quality wheat with the high protein content and high trace elements,858 wheat lines were screened by co-dominant marker Xuhw89 and the full-length ofNAMgene were amplified.Our results showed there were threeTriticumdicoccumvarieties possess the functionalNAM.The nucleotides sequences analysis showed thatNAMof F37 and F40 were respectively consistent with the TaNAC2(GenBank No.HQ872050) and TtNAM-A1(GenBank No.DQ869672).TheNAMof F34 had the closest homology with the TtNAM-B2(GenBank No.DQ869676).Compared to TtNAM-B2,five variation sites were found in F34,including one difference in intron and four in exons,resulting in three amino acid variations.The prediction analysis showed that the variation had no effect on the protein function.This new allelic variation ofNAMgene was named asTdNAM(GenBank No.KU529317).In this study,the new allele ofNAMcould provide the materials and gene resources for breeding wheat varieties with high protein and trace elements content.

Wheat;NAMgene; New allele; Molecular marker; Sequence analysis

时间：2016-07-07

2016-02-25

2016-04-12

国家转基因专项(2016ZX08009003)

E-mail：849429995@qq.com

冯 波(E-mail:fengb2600@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)07-0866-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1530.012.html