苏子剑，柯少迎，费洪江

（福建医科大学附属泉州第一医院 肿瘤外科，福建 泉州 362000）

·经验交流·

CD88在肝细胞癌中的表达及其与预后的关系

苏子剑，柯少迎，费洪江

（福建医科大学附属泉州第一医院 肿瘤外科，福建 泉州 362000）

目的 检测补体5片段受体（complement component 5a receptor）CD88在肝细胞癌组织中的表达情况，探讨其与肝细胞癌患者临床病理参数的关系及其对预后的临床意义。方法 应用免疫组织化学方法检测171例肝细胞癌组织和癌旁组织中CD88的表达情况，并分析CD88与肝细胞癌临床病理特征及预后的关系。结果 CD88在肝细胞癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（Z=-11.540，P＜0.001）。年龄≥50岁（x2= 10.77，P=0.005）、TNM分期I I～I I I（x2=17.31，P=0.002）、肿瘤直径≥5 cm（x2=17.65，P＜0.001），肿瘤数目≥2个（x2=14.68，P＜0.001）、肿瘤侵犯血管（x2=11.05，P＜0.001）者肝细胞癌组织中CD88表达明显偏高（P＜0.05），但患者的性别、术前AFP水平、HbsAg状态、有无腹水和术前肝功Child-Pugh分级与CD88表达无明显相关（P均＞0.05）。单因素分析显示，术前TNM分期、术前肝功能分级、血管浸润、CD88表达、肿瘤大小、肿瘤数目与肝细胞癌患者总生存期相关（P＜0.05），术前肝功能分级、血管浸润、CD88表达、肿瘤大小、肿瘤数目与肝细胞癌患者无进展生存时间相关（P＜0.05）。COX风险模型提示，CD88为影响肝细胞癌总体生存时间和无进展生存时间的独立危险因素。结论 CD88可能参与肝细胞癌的恶性进展，其高表达可能提示肝细胞癌患者预后不良。

癌，肝细胞；补体5片段受体CD88；预后

越来越多的证据表明，全身炎症反应与肿瘤进展，侵袭以及转移有关，其机制主要与炎性细胞、细胞因子、趋化因子在肿瘤微环境的浸润有关。补体系统在炎症过程中自然而然成为主要参与者。补体系统既可对肿瘤的生长提供保护机制，亦有抑制肿瘤生长的作用。研究表明CD88可提供肿瘤生长所需的抑制性免疫微环境。CD88通过与强炎性介质C5a的结合在急性肺损伤、类风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、脓毒血症等病理生理过程中发挥重要作用。最近，有研究发现对于CD88在胃癌[1]、胰腺癌[2]、胆管癌[3]、非小细胞肺癌[4]中表达增加，并与肝内胆管细胞癌血管浸润直接相关，是非小细胞肺癌的独立预后指标。动物模型研究发现CD88的过度激活与犬乳腺癌[5]、子宫颈癌[6]发病相关。但在肝细胞癌中的表达国内研究尚少，本研究拟通过免疫组织化学检测CD88在肝细胞癌组织中表达的情况，探讨其与临床病理参数的关系及对肝细胞癌预后的临床意义。

1 资料和方法

1.1病例资料

选择1996年6月至2007年9月在我院肿瘤外科行肝部分切除术且随访资料完整的171例原发性肝细胞癌患者，所有的患者均由同一组外科医生进行手术治疗，术后病理学检查均证实为原发性肝细胞癌。肝癌组织取材于未坏死肿瘤组织，癌旁组织取材于距离肿瘤边缘2 cm以上肝组织。剔除标准：术前伴有远处转移的病例；研究对象术前进行全身化疗、经导管肝动脉栓塞化疗（TACE）、局部消融等治疗者。所有患者随访至2012年9月1日止。生存时间按月计算，以手术日期起算至死亡日期或末次随访日期。

本组171例患者中男157例，女14例；年龄25～75岁，中位年龄54岁，平均年龄（52.7±12.67）岁；术前CRP水平、HbsAg状态、AFP水平、Child-Pugh分级、腹水情况、肿瘤数目、合并血管浸润者情况、有无血管浸润情况详见表1。

1.2免疫组化实验

临床肝癌及癌旁组织经常规固定、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化。将切片置于柠檬酸抗原修复液中高压1.5 min，自然冷却，PBS冲洗；滴加50 μL即鼠抗人CD88单克隆抗体（1:200，Abcam），室温孵育1 h，PBS冲洗；滴加50 μL即用型MaxVision3检测二抗（福州迈新），室温孵育30 min，PBS冲洗；滴加50 μL DAB显色液（福州迈新），室温孵育5 min，自来水冲洗；苏木素复染、PBS返蓝、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。

1.3免疫组化结果判定

随机采集10个具有代表意义的显微镜视野的肿瘤细胞计数并取平均数值，计算阳性细胞百分比。CD88阳性染色判断标准：胞浆或胞膜有棕黄色颗粒沉着者为阳性染色。依阳性细胞百分率判定阳性强度。阳性细胞数≤10％为“+”，10％～50％为“++”，≥50％为“+++”。

1.4统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计分析。率的比较采用x2检验或者Wilcoxon检验。Kaplan-Meier法统计影响肝癌切除术后术后总生存时间和无进展生存时间的因素，Log-Rank检验比较各组的累积生存率的差异，多因素分析采用Cox比例风险模型，检验水准均为α=0.05，即P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1CD88在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达

免疫组织化学染色显示，肝细胞癌组织中CD88表达明显，CD88主要在细胞膜上表达（褐色），部分细胞细胞浆亦见CD88表达（图1）；癌旁组织CD88呈阴性表达，细胞核未见染色（图2）。19.8％（34/171）肿瘤组织呈低度表达，37.4％（64/171）肿瘤组织呈中等程度表达，42.6％（73/171）的肿瘤组织呈强阳性表达。癌组织与癌旁组织CD88表达差异具有统计学差异（Z=-11.540，P＜0.001）。

图1　CD88在肝细胞癌组织中的表达（Elivision，×400）

图2　C D88在癌旁组织中的表达（Elivision，×400）

2.2CD88表达与临床病理参数的关系

研究发现，年龄≥50岁、TNM分期I I～I I I、肿瘤直径≥5 cm、肿瘤数目≥2个、肿瘤侵犯血管者，肝癌组织中CD88表达明显高于对应组（P＜0.05），但患者的性别、术前AFP水平、HbsAg状态、有无腹水和术前肝功Child-Pugh分级与肝癌组织中CD88表达无明显相关（P均＞0.05）。见表1。

表1　肝癌组织中CD88的表达与患者临床病理参数的关系

2.3肝细胞癌患者总生存时间影响因素分析

单因素分析显示，术前TNM分期、术前肝功能分级、血管浸润、CD88表达、肿瘤大小、肿瘤数目与肝细胞癌患者总生存期相关，TNM分期更晚、肿瘤浸润血管、CD88表达强阳性、肿瘤直径≥5 cm、肿瘤数目≥2个的患者预后更差（见表2）。但患者的性别（x2= 0.202，P=0.653）、年龄（x2=0.479，P=0.489）、术前有无腹水（x2=0.049，P=0.825）、术前AFP（x2=0.032，P=0.857）、HbsAg状态（x2=0.134，P=0.714）与总生存期无关。

将单因素分析有统计学意义的相关因素进行COX风险模型分析显示，CD88表达为肝癌总体生存时间预后的独立危险因素（见表2和图3）。

表2　影响肝细胞癌患者总生存期的单因素和多因素分析

图3　CD88表达与肝细胞癌患者总生存时间的关系

2.4肝细胞癌患者无进展生存时间影响因素分析

单因素分析显示，术前肝功能分级、血管浸润、CD88表达、肿瘤大小、肿瘤数目与肝细胞癌患者无进展生存时间相关，术前肝功能差、肿瘤浸润血管、CD88强阳性、肿瘤直径大于≥5 cm、肿瘤数目≥2个的患者更容易出现肿瘤进展（见表3）。而性别（x2= 1.750，P=0.186）、年龄（x2=0.000，P=0.987）、术前有无腹水（x2=0.005，P=0.944）、术前AFP水平（x2= 0.002，P=0.961）、术前TNM分期（x2=5.876，P=0.053）、HbsAg状态（x2=0.148，P=0.701）与患者无进展生存时间无关。见表3。

将单因素分析有意义的相关因COX风险模型分析显示，CD88表达为影响肝细胞癌无进展生存时间预后的独立危险因素（见图4）。

表3　影响肝细胞癌患者无进展生存时间的单因素和多因素分析

图4　CD88与肝细胞癌患者无进展生存时间的关系

3 讨论

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居肿瘤相关死亡第3位。肝癌在我国高发，目前，我国发病人数约占全球的55％；肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。先天性的遗传改变和后天的高危因子例如的感染、肝硬化、酒精性肝病及黄曲霉素的污染等都是导致肝细胞癌高发的危险因素。通过全基因组表达微阵列分析已证实很多导致失控性生长和异常生存信号的重要通路。但是，还没有有意义的基因标记或预后指标进入到临床实践，因此需进一步研究和寻找肝细胞癌新的诊断及预后标志物。

虽然研究发现CD88在多种肿瘤中表达增高，但对于CD88促进肿瘤侵袭转移的机制，目前尚不清楚。Nabha等[7]通过Transwell小室发现C5a能明显增强癌细胞的侵袭能力，MMP抑制剂GM6001能明显抑制癌细胞的增殖和侵袭能力。有研究表明CD88通过促进基质金属蛋白酶的分泌促进肿瘤的侵袭，提示影响基质金属蛋白酶分泌的多种信号通路可能与CD88的信号传递相关。另一方面，CD88可能通过影响T细胞而影响肿瘤免疫[3]。Dunkelberger等发现细胞内CD88可以发出信号促进T细胞的活化和分化，对T细胞免疫应答产生影响[8]。抑制小鼠表达C5a可以影响肿瘤周边CD68+巨噬细胞[2]。C5a还通过CD88募集髓源性抑制细胞来抑制CD8+T细胞抗肿瘤反应，从而促进肿瘤免疫逃避[4]。Markiewski等证实C5a通过CD88抑制T细胞的抗肿瘤反应，促进肿瘤生长[9]。

有研究发现对于CD88在肝细胞癌、肝内胆管癌等多种肿瘤中表达增加[3]，并与肝内胆管细胞癌血管浸润直接相关，是肝细胞癌的独立预后指标。本研究应用免疫组织化学发现在肿瘤组织中CD88表达明显比癌旁肝组织高，表明CD88表达可能与原发性肝癌的发生发展和恶性行为存在关系，CD88表达水平在年龄大于50岁、TNM分期I I期以上、肿瘤直径大于5 cm，肿瘤数目多于1个，肿瘤侵犯血管者癌组织中表达较高，进一步说明了CD88表达与肿瘤细胞分化、增殖和侵袭转移存在密切关系。通过Cox模型分析发现CD88是影响原发性肝癌总生存时间和无进展生存时间的独立因素，说明CD88不仅在原发性肝癌表达增加，而且术后可以通过检测CD88在肿瘤中的表达水平预测预后，并可能可以指导治疗。

[1] 柯少迎, 苏子剑, 叶晓楠, 等. CD88在胃癌中的表达及其对细胞侵袭能力的影响 [J]. 中国肿瘤外科杂志, 2016, 8(3): 169-172.

[2] CONTRACTOR T, KOBAYASHI S, Da SILVA E, et al. Sexual dimorphism of liver metastasis by murine pancreatic neuroendocrine tumors is affected by expression of complement C5 [J]. Oncotarget, 2016, 7(21): 30585-30596.

[3] NITTA H, WADA Y, KAWANO Y, et al. Enhancement of human cancer cell motility and invasiveness by anaphylatoxin C5a via aberrantly expressed C5a-receptor (CD88) [J]. Clin Cancer Res. 2013, 19(8): 2004-2013.

[4] GU J, DING J Y, LU C L, et al. Overexpression of CD88 predicts poor prognosis in non-small-cell lung cancer [J]. Lung Cancer, 2013, 81(2): 259-265.

[5] HEZMEE M N, KYAW-TANNER M, LEE J Y, et al. Increased expression of C5a receptor (CD88) mRNA in canine mammary tumors [J]. Vet Immunol Immunopathol, 2011, 139 (1): 50-56.

[6] MACIEJ M, MARKIEWSKI, ROBERT A. Modulation of the anti-tumor immune response by complement [J]. Nat Immunol, 2008, 9(11): 1225-1235.

[7] NABHA S M, DOS SANTOS E B, YAMAMOTO H A, et al. Bone marrow stromal cells enhance prostate cancer cell invasion through type I collagen in an MMP-12-dependent manner [J]. Int J Cancer 2008, 122(11): 2482-2490.

[8] DUNKELBERGER J, ZHOU L, MIWA T, et al. C5aR expression in a novel GFP reporter gene knockin mouse: implications for the mechanism of action of C5aR signaling in T cell immunity [J]. J Immunol, 2012, 188(8): 4032-4042.

[9] MARKIEWSKI M M, LAMBRIS J D. et al. Unwelcome complement [J]. Cancer Res, 2009, 69(16): 6367-6370.

（本文编辑：张海燕，鲁翠涛）

Expression of CD88 in hepatocellular carcinoma and its significance on prognosis

SU Zi-jian, KE Shao-ying, FEI Hong-jiang. Department of Oncosurgery, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Quanzhou, FuJian 362000, China

Objective To investigate the expression of complement component 5a receptor CD88 in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and to explore the correlation between expression of CD88 and clincopathological characteristics, to evaluate the prognosis of CD88 in HCC patients. Methods Expression of CD88 was detected by immunohistochemistry in 171 HCC tissues and corresponding adjacent-cancer tissues. Correlation between CD88 expression and clincopathological characteristics and prognosis were analyzed. Results The expression of CD88 in HCC tissues was significantly higher than that in the adjacent-cancer tissues (Z=-11.540, P＜0.001). The expression of CD88 in HCC tissues was higher in HCC patients with age over ≥50 years (x2=10.77, P=0.005), TNM stage II～III (x2=17.31, P=0.002), tumor size≥5 cm (x2=17.65, P＜0.001), tumor number≥2 (x2=14.68, P＜0.001), and vascular invasion (x2=11.05, P＜0.001). There was no significant correlation between CD88 expression and patients’ gender ratio, preoperative AFP level, status of HbsAg, with ascites or not and preoperative Child-Pugh classification (all P＞0.05). In univariate analysis, preoperative TNM stage, Child-Pugh classification, vascular invasion, CD88 expression, tumor size and tumor number were significantly associated with overall survival of HCC patients (P＜0.05). Preoperative Child-Pugh classification, vascular invasion, CD88 expression, tumor size and tumor number were significantly associated with disease-free survival of HCC patients (P＜0.05). In multivariate analysis, the expression of CD88 was independent predictor for overall survival and disease-free survival of HCC patients. Conclusion CD88 may be involved in the malignant progression of HCC, and the over-expression of CD88 maybe suggestt the poor prognosis in HCC patients.

hepatocellular carcinoma; complement component 5a receptor CD88; prognosis

R735.7

A

10.11952/j.issn.1007-1954.2016.06.010

2016-03-18

福建省自然科学基金项目（2014J10435）；泉州市科技计划项目（2013Z58）。

苏子剑（1978-），男，福建南安人，主治医师，硕士。