马诗雨，李如波，罗宇家，吕孟妍，王汉志，王正印（.中国医科大学法医学院法医病理学研究室，辽宁沈阳000；2.中国医科大学临床医学专业，辽宁沈阳000）



CDK5的表达与脑损伤时间推断的相关性研究进展

马诗雨1，2，李如波1，罗宇家1，2，吕孟妍1，2，王汉志1，王正印1
（1.中国医科大学法医学院法医病理学研究室，辽宁沈阳110001；2.中国医科大学临床医学专业，辽宁沈阳110001）

摘要：细胞周期蛋白依赖激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）是CDK家族中一类不直接调控细胞周期的蛋白。CDK5通过靶蛋白的磷酸化在神经细胞的发育、修复及退行性变等方面发挥着不可替代的作用。脑损伤是指暴力作用于头部造成的脑组织器质性损伤，由于损伤发生后机体启动应激及修复机制，脑组织中变化的多种蛋白及酶类物质可作为损伤时间判定的指标。本文就CDK5的分布、活性机制、生理作用及其脑损伤研究与其作为脑损伤标志物可能性的研究进展进行综述。

关键词：法医病理学；脑损伤；综述[文献类型]；细胞周期蛋白依赖激酶5；损伤时间

近年来，随着分子生物学、免疫组织化学的快速发展，细胞周期素依赖蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的生物学特性研究逐渐被重视，但主要集中在与细胞周期调控相关的CDK1、CDK2等，对于不直接涉及细胞周期调控的CDK5及其抑制剂的研究相对匮乏，这些激酶在细胞周期中的作用机制尚未得到完全清晰的解读[1]。在法医病理学领域，脑损伤是一种常见的病理损伤，推断其发生时间需要的标志物多为脑中可检出的活性蛋白、mRNA等。CDK5在哺乳动物大脑中高表达，因此有希望成为法医病理学研究中作为损伤时间推断的标志物，故有必要研究其生理、生化及调节作用。

1 CDK5的分布及作用机制

1.1 CDK5的分布

CDK5是一类不能直接调控细胞周期，但可以参与分裂后神经元的靶蛋白磷酸化，以此对神经元的迁移、突起的生长和轴突模式进行调节的激酶[2]。CDK5最初被认为存在于分裂后、失去增殖能力且CDK家族常常不表达或无活性的神经元中，后发现几乎整个中枢和外周神经系统的神经元都能检测到CDK5转录体的存在[3]。近来多种实验表明，哺乳动物脑组织中含有大量CDK5活性物质，可能参与小神经胶质细胞、少突胶质细胞等许多细胞的分化过程[4]，并在哺乳动物神经系统外（肾、睾丸、卵巢、空肠、回肠和十二指肠）也有中等程度的表达[5]。

1.2 CDK5的产生与激活

单体形式存在的CDK5无激酶活性，需要通过磷酸化特定位点（thr14、thr15、Alb、Ser159等）与其特异性激活因子p35、p39及p35、p39含碳末端的蛋白水解产物p25和p29等结合，锚定在膜上并磷酸化膜性底物，参与平衡促存活和促凋亡信号转导通路调节，以此发挥生物学活性[6]。

1.3 CDK5的生理作用

CDK5虽然不直接调控细胞周期，但其在神经系统发育、退化过程中的作用是复杂多样的，CDK5在机体各系统发挥着不同生理作用。CDK5在神经系统发育形成的整个过程（如神经元的迁移和分化）中的作用是最早被发现的，特别是在中枢神经系统细胞骨架形成中起重要作用。CDK5缺失会导致脑皮质层状细胞性结构缺陷，剔除CDK5或p35-/p39-的小鼠近60%会死亡，而这种现象可以被植入p35启动子下游的CDK5基因转染所逆转[7]，提示活性CDK5在正常神经系统发育中有不可替代的作用。彭芳芳等[8]研究表明，在鼠E12~P14神经组织发育、神经元大量重构、形成神经网络过程中，CDK5蛋白及p35持续高表达，CDK5激酶活性显现，可能通过磷酸化细胞骨架的方式引导神经元形态学改变，调节神经系统发育。

2 CDK5在脑损伤时间推断中的应用

多种实验表明，CDK5在脑组织及神经系统损伤后存在着表达异常，提示其发挥多样的生物学作用。了解CDK5的作用机制有助于从生物学层面验证其作为脑损伤推断标志物的合理性。

2.1基于CDK5的脑损伤研究

2.1.1急性CO中毒性迟发型脑病

研究[9]表明，急性一氧化碳（CO）中毒引发的迟发型脑病发病过程中，CDK5、p25、p35的表达均有明显增高。该研究以morris水迷宫实验筛选出认知功能正常的大鼠，并通过腹腔追加CO、行为学观察、HbCO动态监测等方式建立迟发型脑病大鼠模型。结果发现，在中毒后1周左右，CDK5的异常激活达到高峰。推测CDK5引发迟发型脑病的可能机制为急性CO中毒引发的缺氧性毒性刺激使p35自身表达上调，同时一部分裂解为能完全激活CDK5的p25。由于缺乏膜锚定信号，p25-CDK5复合物在细胞内的定位改变，造成底物磷酸化失调，进一步引发神经元病理性损害。2.1.2神经系统变性疾病

神经系统变性疾病是以中枢神经系统内特定神经元的损伤丢失为特征的一组慢性进展性疾病，近期研究[10]表明，此类神经元损伤中存在CDK5的异常聚集。CDK5诱导神经元凋亡主要通过细胞质途径导致细胞骨架崩解和细胞核途径干扰促存活基因两种不同方式[11]，CDK5酶活性异常引发的tau蛋白异常磷酸化使糖原合成酶激酶3β对tau蛋白的磷酸化易化，从而影响轴浆转运过程，促进了神经退行性病变的发生过程[10]。有研究[12-13]表明，CDK5在轴突导向和靶向性选择方面起重要作用，p35突变会导致某些神经轴突的成簇化和导向生长，CDK5缺陷时运动神经元还会出现染色质融解、细胞气球样变、核偏位伴随神经丝堆积等一系列轴浆运输障碍现象。

2.1.3放射性损伤

在韩永清等[14]模拟大鼠放射性脑损伤模型的实验中，给予培养至12d的海马神经元30 Gy X射线的单次照射，用Western印迹法检测CDK5的激活蛋白p35、p25的水平，并用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况，进一步证实CDK5在脑损伤后存在表达的异常增加。DAPI显示，30 Gy组在照射后24h核固缩百分比为（24.83±3.97）%，其对照组为（1.82±1.08）%；30 Gy+CDK5抑制剂组在照射后24 h核固缩百分比为（7.74±2.27）%；p35蛋白水平在照射后3.5 h和4 h分别比对照组升高（1.51±0.13）、（1.45±0.14）倍，p25蛋白水平在照射后6h比对照组升高（1.62±0.28）倍，各组结果差异均有统计学意义。由此实验可得，X线照射培养海马神经元后造成脑组织放射性损伤，p35、p25蛋白表达在一定时间内随损伤时间呈增加趋势，且应用CDK5抑制剂抑制CDK5活性可以减少神经元的凋亡。

2.2 CDK5随损伤时间变化的评估

李伟等[15]在三叉神经痛大鼠模型中，已证实CDK5/p35对神经系统疼痛信号传递调节的作用，采用Western印迹、CDK5活性分析等方法检验了Vc组织中CDK5及p35的活性时限（三叉神经眶下支慢性压迫性损伤第14天，CDK5活性为第1天的6倍）。上述研究提示，CDK5蛋白在脑损伤后周边区随时间延长表达增多，但具体变化方式尚未明确证实，因此CDK5作为标志物参与脑损伤时间推断具有一定的先进性。

大量研究总结出许多脑损伤时间推断标志物在脑挫伤后的分布有其规律性与特异性，如缺氧诱导因子-1α蛋白、神经病靶酯酶与诱导型环氧合酶、Homer蛋白、载脂蛋白E mRNA、caspase-3在脑挫伤后的表达时限多为单峰[16-19]，肿瘤坏死因子α则为双峰[20]。故而证实，CDK5在脑损伤后表达的变化曲线对其作为标志物应用有较高的可行意义。

3展　望

脑损伤可参考检验的指标众多，实际工作中需要参考实际案例，根据鉴定需求、标本组织部位、峰值出现的时间等指标，选择合适的蛋白或mRNA，采取合适的方式进行分析推断。CDK5正常情况下通过调节底物磷酸化水平调控神经发育、促进轴突生长，在神经系统发育的过程中都有着积极的作用，因此推测其在脑损伤后也必然会有因损伤修复机制启动造成的表达异常。

为探讨大鼠局灶性脑挫伤后脑中p35和p25表达变化的时间规律性，王汉志等[21]进行了大鼠局灶性脑挫伤后p35及p25的表达变化试验。以手术方式建立大鼠局灶性脑挫伤模型，通过HE、免疫组织化学染色及Western印迹法等方法进行损伤不同时间后损伤周边区脑组织p35及p25的蛋白表达检测。结果发现，在局部脑挫伤后，p35蛋白随挫伤时间的延长表达降低，于12h达到低峰，随后表达增加，于5d基本恢复正常表达量，呈现单峰变化。而p25作为p35的蛋白降解产物，是一种较p35更为稳定、具有更强激活CDK5能力的特异性激活因子，随挫伤时间延长呈现双峰变化：挫伤后6 h出现第一个高峰，随后降低至24 h达到低峰，5 d后出现第二次高峰，随后逐渐降低恢复正常。p35与p25是CDK5的特异激活剂，这两种蛋白表达呈现不同的规律性且有较好的时间相关性，为利用CDK5进行脑挫伤时间推断提供了有利的论据。

综上，CDK5有望成为脑损伤时间推断的检测指标，为法医病理学鉴定提供一条新的思路。

参考文献：

[1]刘文虎，常晋霞，王仕宝.细胞周期蛋白依赖性激酶及其抑制剂构效关系研究进展[J].国际药学研究杂志，2014，41（1）：37-44，56.

[2] Connell-Crowley L，Le Gall M，Vo DJ，et al. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo[J]. Curr Biol，2000，10（10）：599-602.

[3] Ino H，Ishizuka T，Chiba T，et al. Expression of CDK5（PSSALRE kinase），a neural cdc2-related protein kinase，in the mature and developing mouse central and peripheral nervous systems[J]. Brain Res，1994，661（1-2）：196-206.

[4] He X，Takahashi S，Suzuki H，et al. Hypomyelination phenotype caused by impaired differentiation of oligodendrocytes in Emx1-cre mediated Cdk5 conditional knockout mice[J]. Neurochem Res，2011，36（7）：1293-1303.

[5] Zheng YL，Li BS，Kanungo J，et al. Cdk5 Modulation of mitogen-activated protein kinase signaling regulates neuronal survival[J]. Mol Biol Cell，2007， 18（2）：404-413.

[6]陈洁，王中峰.细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5在中枢神经系统发育和神经退行性疾病中的作用[J].生理学报，2010，62（4）：295-308.

[7] Dhariwala FA，Rajadhyaksha MS. An unusual member of the Cdk family：Cdk5[J]. Cell Mol Neurobiol，2008，28（3）：351-369.

[8]彭芳芳，张百芳，章江洲，等.发育、成年及老年期大鼠脑中Cdk5，p35，p39的表达及Cdk5激酶活性变化[J].卒中与神经疾病，2001，8（6）：350-353.

[9]李勇军，刘强，赵春梅，等.急性CO中毒迟发脑病大鼠海马中CDK5、p35及p25的表达[J].脑与神经疾病杂志，2012，20（4）：241-244.

[10]张红丽，刘亚玲. CDK-5在神经系统变性疾病的研究进展[J].医学综述，2012，18（19）：3166-3169.

[11] Rashidian J，Rousseaux MW，Venderova K，et al. Essential role of cytoplasmic cdk5 and Prx2 in multiple ischemic injury models，in vivo[J]. J Neurosci，2009，29（40）：12497-12505.

[12] Paglini G，Cáceres A. The role of the Cdk5--p35 kinase in neuronal development[J]. Eur J Biochem，2001，268（6）：1528-1533.

[13]范瑞文，张俊珍，刘佳，等.细胞周期素依赖蛋白激酶5 （CDK5）研究进展[J].畜牧兽医杂志，2010，29（6）：47-49.

[14]韩永清，孙爱民，刘鹊凌，等. X线照射原代培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及Cdk5激酶活性变化[J].南方医科大学学报，2009，29（3）：405-407，411.

[15]李伟，方敏，才晓慧.三叉神经痛大鼠模型中Cdk5/p35的表达与活性[J].上海口腔医学，2010，19（5）：545-548.

[16]刘玉利，田亚汀，田晓菲，等.大鼠脑挫伤后NTE与COX-2表达随时间的变化[J].中国法医学杂志，2014，29（1）：22-24，29.

[17]王福远，李如波，梁红霞，等.大鼠局灶性脑挫伤后Homer蛋白表达变化[J].法医学杂志，2011，27（6）：409-412.

[18] Iwata A，Browne KD，Chen XH，et al. Traumatic brain injury induces biphasic upregulation of ApoE and ApoJ protein in rats[J]. J Neurosci Res，2005，82（1）：103-114.

[19]蔡红星，李周儒，程言博，等. Caspase 3和iNOS在人挫伤脑组织中的时序性表达[J].法医学杂志，2009，25（4）：241-245.

[20]严治，孙小丽，胡玉莲，等.大鼠脑挫伤后脑与其他器官组织中TNF-α表达的比较[J].法医学杂志，2012，28（4）：261-264.

[21]王汉志，李如波，王正印，等.大鼠局灶性脑挫伤后p35 及p25的表达变化[J].法医学杂志，2015，31（2）：93-96.

（本文编辑：张建华）

·经验交流·

Progress on Correlation between the Expression of CDK5 and Brain Injury Time

MA Shi-yu1,2, LI Ru-bo1, LUO Yu-jia2, LÜ Meng-yan2, WANG Han-zhi1, WANG Zheng-yin1
（1. Department of Forensic Pathology, School of Forensic Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Specialty of Clinical Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China）

Abstract：Cyclin-dependent kinase 5（CDK5）is a member of cyclin-dependent kinase family, which does not directly regulate cell cycle. Through phosphorylation of target protein, CDK5 plays an irreplaceable role in the development, reparation and degeneration of neurons. Brain injury refers to the organic injury of brain tissue caused by external force hit on the head. Owing to the stress and repair system activated by our body itself after injury, various proteins and enzymes of the brain tissues are changed quantitatively, which can be used as indicators for estimating the time of injury. This review summarizes the progress on the distribution, the activity mechanism and the physiological effects of CDK5 after brain injury and its corresponding potential served as a marker for brain injury determination.

Key words：forensic pathology; brain injuries; review [publication type]; cyclin-dependent kinase 5; injury time

收稿日期：（2014-08-20）

通信作者：李如波，男，博士，教授，主要从事法医病理学教学、研究及鉴定；E-mail：rbli@mail.cmu.edu.cn

作者简介：马诗雨（1993—），女，硕士研究生，主要从事临床医学、法医病理学研究；E-mail：magic23@yeah.net

基金项目：辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2013317）；辽宁省自然科学基金项目（2014021027）

文章编号：1004-5619（2016）01-0058-03

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.013