戎 伟，梅双双

（1.海南大学农学院，海南 海口 570228；2.海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 570228）

SGT1正调控橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病性

戎 伟1，梅双双2

（1.海南大学农学院，海南 海口 570228；2.海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 570228）

通过在拟南芥野生型Col-0和突变体sgt1b、eds1上接种橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106，分析了白粉菌细胞进入率、叶片发病症状、菌丝生长状态、细胞死亡和活性氧产生等表型。结果表明，与野生型Col-0相比，橡胶树白粉菌在拟南芥sgt1b上激发的早期抗病性、后期抗病性以及抗病反应部分降低，暗示着SGT1在稳定识别橡胶树白粉菌的抗性蛋白方面发挥着非常重要的作用。

橡胶树白粉菌；拟南芥；SGT1；抗病性

SGT1 （Suppressor of G-Two Allele of Skp1）是与着丝粒装配和蛋白泛素化有关的基因，最早在酵母中被发现［4］，在模式植物拟南芥和烟草以及大麦等许多植物中都有发现，且大多数植物包括SGT1a和 SGT1b两个基因。通过在烟草或拟南芥中进行基因沉默、突变和过表达等试验表明，SGT1与植物抗性基因介导的抗病反应密切相关［5-11］。SGT1基因沉默或突变会导致一些抗性基因表达下调以及介导的抗性反应消失［6］。反之，SGT1基因超表达会增强植株的抗病能力［8］。最近研究发现，SGT1、RAR1作为HSP90的分子伴侣蛋白，三者在植物体内相互作用，对R蛋白的积累与稳定性具有重要作用［12-13］。

作为HSP90的伴侣蛋白，RAR1参与了橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病性［3］，但SGT1是否具有RAR1相同的功能目前仍然未知。由于sgt1a和 sgt1b双突变体拟南芥是致死的表型，因此本研究选择了sgt1b单突变体，通过在拟南芥野生型Col-0、突变体sgt1b和eds1上接种橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106，进行了白粉菌细胞进入率、菌丝生长抗性、叶片发病症状、细胞死亡、活性氧产生及致病相关基因PR1 （Pathogenesis-related gene 1）表达等表型分析，发现SGT1b 参与了橡胶树白粉菌激活的抗病性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料：橡胶树73397，拟南芥野生型Col-0，拟南芥突变体eds1［14］，拟南芥突变体sgt1b［15］。

供试菌株：橡胶树白粉菌Oidium heveae HN1106［3］。

1.2 试验方法

1.2.1 SGT1基因参与拟南芥对橡胶树白粉菌的早期抗性分析 （1）白粉菌细胞进入率计算：利用接种箱接种橡胶树白粉菌，接种1 d后，剪取叶片置于脱色液（乙醇 20 mL，苯酚 10 mL，H2O 10 mL，乳酸 10 mL）中脱色过夜。将叶片于染色液（考马斯亮蓝 G250，0.6% 乙醇溶液）中染色30 s，显微镜观察，计数拟南芥叶片上含有1根芽管和2根芽管的白粉菌孢子数目［3］，计算白粉菌细胞进入率。

（2）菌丝生长长度分析：接种橡胶树白粉菌2 d后，剪取叶片置于脱色液中脱色过夜。将叶片于考马斯亮蓝染色液中染色30 s，显微镜观察，利用MIE 3.1软件分析菌丝生长长度［3］。

1.2.2 SGT1基因参与拟南芥对橡胶树白粉菌的后期抗性分析 （1）叶片发病症状观察：接种橡胶树白粉菌10 d后，观察叶片发病症状，拍照。

（2）菌丝生长状态观察：接种橡胶树白粉菌10 d后，剪取叶片置于脱色液中脱色过夜。将叶片在考马斯亮蓝染色液中染色30 s，显微镜观察菌丝生长状态。

1.2.3 SGT1基因参与橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病反应分析 （1）叶片细胞死亡观察：接种橡胶树白粉菌10 d后，剪取叶片置于Trypan blue染色液（乙醇20 mL，苯酚10 mL，H2O 10 mL，乳酸溶液10 mL，Trypan blue 10 mg）中，染色100℃ 2 min后倒掉染料，加入脱色液（水合三氯乙醛12.5 g，H2O 10 mL）脱色过夜。显微镜下观察细胞死亡状态［16］。

（2）活性氧产生观察：接种橡胶树白粉菌10 d后，剪取叶片置于DAB染液（1 mg/mL二氨基联苯胺，pH 3.8）染色12 h，清水洗去多余染料，置于95%乙醇脱色过夜。显微镜下观察活性氧产生情况［17］。

（3）拟南芥RNA提取和PR1基因表达检测：剪取叶片置于预冷的研钵中，加入液氮，反复研磨3次。加入1 mL Invitrogen Trizol溶液，随后加入200 μL三氯甲烷抽提蛋白。经异丙醇沉淀后，加入DEPC H2O 50 μL。DNA酶37℃消化1 h，氯仿抽提，无水乙醇沉淀，DEPC H2O溶解备用。利用Invitrogen RNA反转录试剂盒II进行反转录。Real-time PCR反应体系：

SYBR®Premix Ex TaqⅡ 10 μL，20 μmol/L PCR Forward Primer 0.2 μL，20 μmol/L PCR Reverse Primer 0.2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板5 μL，ddH2O 4.2 μL。反应程序：预变性 95℃ 30 s；变性95℃5 s、退火延伸62℃ 40 s，40个循环［18］。

2 结果与分析

2.1 SGT1基因参与拟南芥对橡胶树白粉菌的早期抗性分析

图1 拟南芥对橡胶树白粉菌的细胞进入抗性和菌丝生长抗性部分依赖于SGT1基因

为了检测SGT1基因是否参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的早期抗性，分析了橡胶树白粉菌在拟南芥上的细胞进入率与菌丝生长长度。接种1 d后，结果表明，sgt1b突变体的白粉菌细胞进入率显著高于野生型Col-0（图1A），但低于eds1突变体白粉菌细胞进入率。接种2 d后发现，野生型Col-0菌丝长度为50 μm左右，sgt1b突变体菌丝长度为130 μm左右，是野生型植物的2倍多，差异达极显著，eds1突变体菌丝长度为230 μm左右（图1B）。综上结果表明，SGT1基因参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的早期抗性。

2.2 SGT1基因参与拟南芥对橡胶树白粉菌的后期抗性分析

为了检测SGT1基因是否参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的后期抗性，我们对叶片发黄表型和菌丝生长状态进行观察。对野生型植物Col-0、突变体sgt1b和突变体eds1接种橡胶树白粉菌10 d后，发现橡胶树白粉菌在野生型植物上出现明显的发黄表型，eds1突变体上表现出典型的白粉病病斑，但在sgt1b突变体上几乎不能看到发黄的表型（图2A，封三），说明橡胶树白粉菌在拟南芥突变体sgt1b上不激活发黄的表型。进一步利用考马斯亮蓝染色的方法观察菌丝的生长状况。显微镜下发现，野生型植物没有形成菌丝网络，在拟南芥eds1突变体上形成大量浓密的菌丝网络，sgt1b突变体表现出稀疏的菌丝网络（图2B，封三）。综上结果表明，SGT1基因参与了拟南芥对橡胶树白粉菌的后期抗性。

2.3 SGT1基因参与橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病反应分析

为了进一步确定SGT1基因是否参与橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病反应，我们在拟南芥上检测了细胞死亡、活性氧产生以及PR1基因表达。接种橡胶树白粉菌10 d后，通过Trypan blue染色，与野生型植物相比，发现橡胶树白粉菌在sgt1b突变体上激活的细胞死亡明显减少（图3A，封三）。通过DAB染色，发现sgt1b和eds1突变体上的活性氧产生与野生型植物相比大大降低（图3B，封三）。荧光定量PCR反应结果表明，橡胶树白粉菌在sgt1b突变体上激发的PR1基因表达也显著下降（图3C，封三）。综上结果表明，SGT1基因参与橡胶树

白粉菌在拟南芥上激活的抗病反应。

3 结论与讨论

在植物与病原菌相互作用的过程中，植物利用自身的抗性蛋白可以识别病原菌从而激活抗病反应，以达到抵御病原菌的侵染。在植物抗性蛋白介导的信号通路中，SGT1、RAR1与HSP90三者相互作用，在稳定抗性蛋白方面发挥重要作用［8］。但SGT1与RAR1在不同的抗性蛋白介导的抗病反应中，发挥的功能可能并不相同。例如，马铃薯晚疫病的抗性基因RB只需要SGT1，但不需要RAR1。因此，SGT1是否像RAR1参与橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病性，目前仍然未知［19］。本研究结果表明，橡胶树白粉菌在sgt1b突变体上激发的早期抗病性、后期抗病性以及各种抗病反应部分降低，说明SGT1在稳定识别橡胶树白粉菌的抗性蛋白上也发挥着重要功能。然而，识别橡胶树白粉菌的TIR-NB-LRR类抗病基因是什么还需要进一步研究鉴定。

值得注意的是，橡胶树白粉菌并不能在sgt1b上形成分生孢子，意味着橡胶树白粉菌不能在sgt1b上完成生活世代，这可能是由于识别橡胶树白粉菌的抗性蛋白不只1个，而是多个抗性蛋白共同发挥作用，但SGT1可能只对其中的某个（些）蛋白的稳定性发挥功能。

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（责任编辑 崔建勋）

Positive regulation effect of SGT1 on disease resistance triggered by Oidium heveae in Arabidopsis

RONG Wei1，MEI Shuang-shuang2
（1.College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Oidium heveae is an obligate biotrophic pathogen which infects Hevea brasiliensis and causes powdery mildew disease of rubber trees. It has been reported that O. heveae HN1106 triggers the hypersensitive response in a manner that depends on the effector-triggered immunity proteins EDS1，PAD4，and RAR1 in the model plant Arabidopsis thaliana. As co-chaperones of HSP90，Arabidopsis RAR1 and SGT1 are required to stabilize some R proteins. However，it is still unknown whether SGT1 is involved in O. heveae triggered disease resistance in Arabidopsis. In this study，WT Col-0，sgt1b and eds1 mutants were inoculated with O. heveae HN1106，and the phenotypes of O. heveae cell entry ratio，plant disease symptoms，cell death，ROS production and O. heveae HN1106 hyphal growth were analyzed. These results indicated that SGT1 was required for O. heveae HN1106-triggered early stage and late stage disease resistance and defense responses.

Oidium heveae；Arabidopsis；SGT1；disease resistance

Q945.8

A

1004-874X（2016）10-0112-05

2016-07-12

国家自然科学基金（31560296）

戎伟（1978-），男，博士，讲师，E-mail：rongwei13@126.com

梅双双（1975-），女，博士，讲师，E-mail：mssrw2002@126.com

戎伟， 梅双双. SGT1正调控橡胶树白粉菌在拟南芥上激活的抗病性［J］.广东农业科学，2016，43（10）：112-116.

橡胶树白粉菌（Oidium heveae）是一种专性活体寄生真菌，主要侵染橡胶树的嫩叶、嫩芽和花序，使橡胶树产生白粉病，对天然橡胶的产量造成极大影响［1-2］。目前学者对橡胶树和橡胶树白粉菌二者的遗传背景不甚了解，难以进行遗传操作，对两者的互作机制了解非常少。最新研究发现，橡胶树白粉菌在模式植物拟南芥上激活抗病反应，该抗病反应依赖于EDS1 （Enhanced Disease Susceptibility 1）、PAD4（Phytoalexin Deficient 4） 和RAR1 （Required for Mla12 Resistance） ，表明拟南芥Toll-Interleukin1 Receptor （TIR）-nucleotide binding （NB）-

leucine-rich repeat （LRR） 类抗病基因参与了橡胶树白粉菌激活的抗病性［3］。 拟南芥遗传背景清晰，因此，橡胶树白粉菌与拟南芥的相互作用为将来研究橡胶树白粉菌的致病机理提供了很好的模型。