朱育菁，刘 波，郑梅霞,陈 峥

(福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福建 福州 350003)



芽胞杆菌来源沙奎那维的检测与分析

朱育菁，刘 波*，郑梅霞,陈 峥

(福建省农业科学院农业生物资源研究所, 福建 福州 350003)

对阿氏芽胞杆菌BacillusaryabhattaiFJAT-14220发酵液中沙奎那维成分进行分析与检测。采用高效液相四级杆飞行时间质谱(liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry)分析阿氏芽胞杆菌FJAT-14220发酵液中胞外代谢物的成分。为获得代谢物的信息，首先采用MassHunter软件对原始数据进行分子特征提取，再通过Metlin数据库检索比对。在阿氏芽胞杆菌FJAT-14220发酵液中检测到883种代谢物，通过Metlin谱库搜索获得初步鉴定的有148种。其中，发现了具有生物活性的物质沙奎那维Saquinavir，其匹配得分达到93.08，占发酵液总代谢物相对含量的1.73%，保留时间为2.719 1 min，精确质量数为670.383 7。沙奎那维的发现为阿氏芽胞杆菌来源的多醚类抗生素的开发与利用提供理论依据。

液相四级杆飞行时间质谱；阿氏芽胞杆菌；胞外代谢物；沙奎那维

沙奎那维(Saquinavir)，CAS:127779-20-8。化学名称：N1-[(1S,2R)-3-[(3S,4aS,8aS)-3-[(叔丁基氨基)甲酰]八氢-2(1H)-异喹啉基]-2-羟基-1-苄基丙基]-2-[(2-喹啉甲酰)氨基]-丁二酰胺；中文名称：沙奎那韦；沙喹那韦；沙奎那维；双喹纳韦；赛科纳瓦D9；是1995年美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准的第一个治疗艾滋病的蛋白酶抑制剂。沙奎那维具有高效、高选择性的特点，在急性感染的淋巴样肝细胞中对HIV-1、HIV-2及对齐多夫定产生耐药性的HIV-1的强大的抗病毒活性[1-2]，并与其他抗逆转录病毒药物如利托那韦[3]有协同作用[4]，与中草药也存在相互作用[5]，而且能抑制恶性疟原虫的生长[6]。之前，沙奎那维都是采用化学合成的方式生产，未见该化合物产生于微生物的报道。

阿氏芽胞杆菌Bacillusaryabhattai在自然界中分布广泛，有报道Shivaji等[7]从高层空气中，Wen等[8]从深海水中，Lee等[9]从土壤中分离到阿氏芽胞杆菌。阿氏芽胞杆菌也能产生多种多样的生物活性物质，能降解碳水化合物和木质纤维素[8]；促进意大利苍耳的生长[9]；且其能产胞外L-左旋天冬酰胺酶[10]，具有抗肿瘤作用[11]。

本研究利用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-QTOF-MS)技术在阿氏芽胞杆菌发酵液中发现了活性成分沙奎那维，即首次在芽胞杆菌中发现沙奎那维。这为沙奎那维的来源提供新途径，并为进一步探索阿氏芽胞杆菌的生理生化特征提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：阿氏芽胞杆菌 FJAT-14220，现保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所，引进自德国菌种保存中心(DSMZ)。

培养基：以NA培养基为活化培养基；以购自美国BD公司的TSB培养基为种子培养基和发酵培养。

试剂：色谱纯methanol(乙醇)、色谱纯acetonitrile(乙腈)均购自美国JT Baker公司，色谱纯ammonium acetate(乙酸铵)购自上海安谱科学仪器有限公司。

仪器：美国安捷伦科技公司的液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪Agilent 1260/6520；瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司的电子天平METTLER TOLEDO AL104；上海智城分析仪器有限公司的恒温培养震荡器智城ZHWY-2102C；德国赛托利斯公司的pH计Sartorius PB-10。

1.2 试验方法

发酵液制备：采用平板划线法活化阿氏芽胞杆菌FJAT-14220菌株，培养条件为：培养基为TSB培养基；转速为170 r·min-1；温度为30℃；培养时间为48 h。

样品制备方法参照文献[12]：用甲醇提取阿氏芽胞杆菌发酵液中的活性物质。

色谱质谱条件：Zorbax SB-Aq C18 2.1×100 mm，色谱柱1.8 μm；柱温30℃；进样量2 μL；乙酸铵水溶液 A=10 mmol·L-1，流动相B=甲醇；梯度程序0 min B= 5%、8 min B= 5%、38 min B= 95%、45 min B= 95%、47 min B= 5%、55 min B= 5%；流速0.3 mL·min-1；MS运行条件：离子模式为负离子模式；干燥气N2的温度350℃；干燥气流速5 L·min-1；Nebulizer 30 psig；Skimmer 65.0 V；Fragmentor 100 V；Capillary voltage 3 500 V；Mass range 100～3 000 m·z-1。

2 结果与分析

2.1 阿氏芽胞杆菌FJAT-14220发酵液物质成分分离

阿氏芽胞杆菌FJAT-14220发酵液LC-MS总离子流图如图1所示，发酵液中共有883种物质，其中经数据库初步鉴定的有148种，匹配得分高于80的13种物质详见表1。含量大于1%的有3种：(1)N,N-二乙基甘氨酸(N,N-Diethylglycine)，相对含量为1.03%；(2)4-羟脯氨酸(4-Oxoproline)，相对含量为1.11%；(3)沙奎那维(Saquinavir)，相对含量为1.73%。

序号化合物名称分子式匹配得分分子量质荷比保留时间/min相对含量/%CAS号KEGG号16⁃hydroxycaproicacidC6H12O399071320785131071220668045-C061032N，N⁃DiethylglycineC6H13NO298921310944130087214177103-C166473GangliosideGD2(d18：1/14：0)C75H131N3O349818161786071616851324205050--4Oleicacid(d2)C18H32D2O2972728426782832606456347069--5SaquinavirC38H50N6O593086703837669376727191173127779⁃20⁃8C072436ThreonolactoneC4H6O4873511802671170194144204621730⁃93⁃8-74⁃OxoprolineC5H7NO38716129042312803513205111-C0187782，4⁃dihydroxy⁃butanoicacidC4H8O48599120042211903513204009--9HedamycinC41H50N2O118570746338274533093336403111048⁃97⁃8C1575910ArbekacinC22H44N6O10856755231025513032018905451025⁃85⁃5-11N⁃dodecanoyl⁃L⁃Homoserinelactone⁃3⁃hydrazone⁃biotinC26H43N5O5S84265372984536291127215007--12CypendazoleC16H19N5O38179329149332814251494900828559⁃00⁃4C18917132alpha⁃Fluoro⁃17beta⁃hydroxyandrost⁃4⁃en⁃3⁃oneC19H27FO2815230619893411675404596004-C15276

2.2 阿氏芽胞杆菌FJAT-14220发酵液中沙奎那维成分分析

阿氏芽胞杆菌FJAT-14220发酵液中沙奎那维的色谱图见图2、3，可知沙奎那维物质的保留时间为2.719 1 min，该物质峰的相对丰度为1.107×105。沙奎那维的同位素峰图(图4)和质谱图(图5)提供了沙奎那维的同位素峰的相对强度及间距。根据在负离子模式(本试验采用的电离方法)下能产生不同的分子离子(如[M+X]-、[M-H]-等，X为溶剂或缓冲剂阴离子)，判断669.376 7峰为[M-H]-准分子离子峰，测得精确即分子质量为670.383 7，而实际精确分子质量为670.384 3，质量偏差为-0.895×10-6。综合分子式、同位素峰和匹配值(Metlin库)，将该成分基本确定为沙奎那维。

3 讨论与结论

阿氏芽胞杆菌发酵液中的活性物质通过LC-QTOF-MS技术进行分析，其中相对含量大于1%的化合物，可分为两类：(1)氨基酸：4-羟脯氨酸；N,N-二乙基甘氨酸；(2)蛋白酶抑制剂：沙奎那维。

沙奎那维是一种特异性的人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制剂，这使对艾滋病的治疗有突破性进展，因为沙奎那维能防止病毒母体蛋白分裂成新的HIV感染细胞和病毒复制的功能蛋白[13]。可通过纳米技术[14]、辅料聚氧乙烯蓖麻油[15]等增强沙奎那维的细胞吸收、运输和口服吸收。沙奎那维主要还是通过化学合成，如赵秀雅[16]先合成2个重要中间体N-(2-喹啉基羰基)-L-天冬酰胺、氯醇，再合成中间体(2S,3S)-N-(N-2′-喹啉甲酰基-(S)-天冬酰胺)-4-苯基-3-氨基-1-氯-2-丁醇，最后与DHIQ耦合制备沙奎那韦； 李荣梅[17]以中间体氯醇、喹啉甲酸、天冬酰胺和DHIQ合成了HIV蛋白酶抑制剂沙奎那韦；闫建辉等[18]采用平行-连续发合成沙奎那维。

目前抗HIV治疗费用居高不下的主要原因是由于沙奎那维的药物合成工艺难度大[18]。而本课题组首次从芽胞杆菌的发酵液中发现了沙奎那维，说明阿氏芽胞杆菌能够产生活性次生代谢物，这将为多醚类抗生素(阿氏芽胞杆菌来源)的开发与利用提供理论依据，值得进一步开发应用。

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(责任编辑：林海清)

Formation and Determination of Saquinavir from Liquid Fermentation ofBacillusaryabhattaiFJAT-14220

ZHU Yu-jing, LIU Bo*, ZHENG Mei-xia, CHEN Zheng

(AriculturalBio-resourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou，Fujian350003，China)

Extracellular metabolites ofBacillusaryabhattaiFJAT-14220 during fermentation were analyzed with liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Saquinavir in the fermentation broth was targeted for the study. Molecular feature extraction and database retrieval were applied to access the information on the metabolites ofB.aryabhattai. A total of 883 compounds were detected with 148 of them identified. The matching score of saquinavir was 93.08 with a relative concentration of 1.73%. Its retention time was 2.7191 min; and, accurate mass, 670.3837. The results could be the foundation for future development and utilization of saquinavir byB.aryabhattaifermentation.

liquid chromatography-hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Bacillusaryabhattai; extracellular metabolites; saquinavir

2015-11-11初稿；2016-04-29修改稿

朱育菁(1972-)，女，博士，研究员，主要从事农业生物药物与生物防治的研究(E-mail: zyjingfz@163.com)

*通讯作者：刘波(1957-)，男，博士，研究员，主要从事微生物生物技术及农业生物药物研究(E-mail：fzliubo@163.com)

公益性行业(农业)科研专项 (201303094)；福建省农业科学院杰出青年人才基金项目(2014JQ-2)；福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1018-11)

Q 939.9

A

1008-0384(2016)09-981-05

朱育菁，刘波，郑梅霞,等.芽胞杆菌来源沙奎那维的检测与分析[J].福建农业学报，2016，31(9)：981-985.

ZHU Y-J，LIU B，ZHENG M-X，et al.Formation and Determination of Saquinavir from Liquid Fermentation ofBacillusaryabhattaiFJAT-14220[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：981-985.