施满容，龚林光，陆志平，雷忠涌，周三女

(1.宁德职业技术学院，福建 福安 355000；2.福安市质量监督检验所，福建 福安 355000)



闽东野生金线莲有效成分含量的比较

施满容1，龚林光2，陆志平1，雷忠涌1，周三女1

(1.宁德职业技术学院，福建 福安 355000；2.福安市质量监督检验所，福建 福安 355000)

为探究闽东野生金线莲有效成分含量的差异，采用紫外分光光度法测定闽东4个县、福安5个海拔高度野生金线莲有效成分的含量。研究结果：多糖含量在5.60%～6.20%，总氨基酸含量在3.48%～3.95%，总黄酮含量在0.55%～0.82%，总生物碱含量在0.062%～0.098%。方差分析及多重比较的结果表明, 闽东不同县以及不同海拔野生金线莲有效成分含量有显著差异。多糖、总生物碱含量以周宁县最高，总氨基酸、总黄酮含量以寿宁县最高，与福安、柘荣金线莲比较，达到极显著差异或显著差异水平。多糖含量随着海拔高度增加而增加，差异显著，海拔730、840 m金线莲多糖含量与海拔420、530 m金线莲比较，达到极显著或显著差异水平；总氨基酸含量随着海拔高度升高有增加趋势，但差异不显著；总黄酮、总生物碱含量在海拔420～730 m随着海拔高度增加而增加，海拔730、840 m金线莲总黄酮、总生物碱含量与420 、530 m金线莲比较达到极显著差异水平。总之，多糖、黄酮、生物碱含量在650 m以上海拔与650 m以下海拔之间有显著差异，650 m以上3种海拔之间有效成分差异不显著。结果表明，植物组织培养种质资源可以优先选择寿宁、周宁产地野生金线莲，人工栽培金线莲可以选择在650 m以上的区域地带，可能更有利于有效成分的积累。

闽东；野生金线莲；有效成分含量

金线兰Anoectochilusroxburghii，俗称金线莲，系兰科开唇兰属植物。 金线莲是一种多年生的珍贵中草药，在民间使用范围较广，素有“药王”、“神药”、“金草”、“乌人参”等美称[1]。化学成分研究表明金线莲含有多糖、氨基酸、生物碱、黄酮、微量元素、强心苷类、有机酸、甾体化合物等多种成分[2-6]。金线莲对生态环境要求严格，加之人工过度采挖，野生金线莲资源日渐枯竭。本课题组对闽东野生金线莲资源调查的结果表明，闽东野生金线莲主要分布在海拔400～900 m的毛竹林、阔叶林或竹阔混生林[7]，闽东不同地点不同海拔高度野生金线莲有效成分是否存在差异，目前还未见报道。为了合理开发利用当地金线莲资源，可进行组培快繁和人工栽培，解决市场需求，组织快繁种质资源选择是关键，因此对当地野生金线莲主要有效成分进行测定具有一定的现实意义。本研究采用紫外分光光度法对闽东4个县、福安5个不同海拔地点的野生金线莲有效成分，包括多糖、氨基酸、黄酮和生物碱含量进行测定，探讨金线莲有效成分与其生长地和海拔高度之间的关系，有助于加快金线莲种质资源的基础研究，为良种选育及新品种的创新，为人工栽培金线莲种质资源和适宜海拔高度的选择，为进一步更好地开发利用闽东金线莲资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

闽东9个地点野生金线莲(材料经宁德师范学院陈勇教授鉴定为兰科茄叶开唇兰)，分别是福安、柘荣、寿宁、周宁、福安1号坑里坑(海拔420 m)、福安2号坑里坑(海拔530 m)、福安3号马洋村(海拔650 m)、福安4号龙洋村(海拔730 m)、福安5号东源村(海拔840 m)。4个县海拔高度变化是周宁>寿宁>柘荣>福安。

1.2 仪器及药品

7520型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司；EYELA N-1000旋转蒸发仪购自EYELA公司；SHB-III循环水式真空泵购自河南郑州长城科工贸有限公司；EASYpure II超纯水仪购自BarnsTead公司；Sartorius BS 210S 电子天平购自Sartorius公司。芦丁、甘氨酸、盐酸麻黄碱标准品购自上海江莱生物科技有限公司；无水葡萄糖、三氯化铝、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、氰化钾、乙二醇甲醚、茚三酮等，实验所用药品均为分析纯，市售。

1.3 取样方法

采用随机取样，课题小组成员于 2015 年10～11 月收集闽东不同县及不同地点的金线莲样品共9份，各样品于2015年11月下旬进行测定，测定结果数据用农博士育种软件进行方差分析，采用Duncan新复极差多重比较。

1.4 样品处理方法

取金线莲植株蒸馏水洗净，置于烘箱中 60℃烘干至恒重，粉碎，研钵研磨，40目网筛过滤，装入密封袋中置于干燥锅贮藏备用。

1.5 多糖含量的测定

1.5.1 标准曲线的制作 参考林丽清等报道的苯酚-硫酸法[8]。在490 nm 波长处测定吸光度，以葡萄糖浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.2 样品液的制备 精确称取金线莲样品500 mg，置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，于80℃水浴加热90 min，取出冷却至室温，提取液摇匀后过滤。滤液中加入50.0 mL无水乙醇，6 000r·min-1离心，弃上清液，沉淀用90%的乙醇洗涤2次，6 000 r·min-1离心，弃上清液，沉淀加水溶解，定容至25 mL，即得样品液。

1.5.3 样品多糖含量的测定 精确吸取经稀释一定倍数的样品液0.2 mL，按1.5.1 中的显色方法测定吸光度，以葡萄糖为标准品，根据公式y=[(A+0.0575)×K]/292.8(注：A表示吸光度，K表示样品稀释倍数，下同)计算金线莲中多糖浓度。

1.6 总氨基酸含量的测定

1.6.1 标准曲线的制作 参考李红武等[9]报道的茚三酮比色法。选择波长570 nm进行比色，以氨基酸质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。

1.6.2 样品液制备 精确称取金线莲样品500 mg，置于研钵中加少量80%乙醇，研磨成匀浆，移于25 mL容量瓶中，用乙醇将残渣洗入瓶中，最后定容至刻度。过滤，在室温下减压蒸发干燥，蒸发的最后阶段在表面皿上进行，得到固形物。使用前用蒸馏水溶解，定容至25 mL，即得样品液。

1.6.3 样品总氨基酸含量的测定 精确吸取经稀释一定倍数的样品液1 mL，按1.6.1 中的显色方法测定吸光度，以氨基酸为标准品，根据公式y=[(A+0.0479)×K]/208.9，计算金线莲中总氨基酸含量。

1.7 黄酮含量的测定

1.7.1 标准曲线的制作 采用三氯化铝显色法测定，以芦丁为标准品，精密称取芦丁标准品4.0 mg，用乙醇溶解后定容至10 mL，配成0.4 mg·mL-1的标准溶液。吸取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别至10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀。分别取1 mL上述芦丁标准溶液稀释液于10 mL干净试管中，加入1%三氯化铝溶液0.5 mL以及30%乙醇2.0 mL，振荡摇匀，静置反应15 min后在420 nm波长下测定吸光度值，以卢丁浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。

1.7.2 样品液制备 精确称取金线莲样品500 mg，置于锥形瓶中，加无水乙醇25 mL，超声处理(功率350 W，频率50 kHz，温度60℃)2 h，滤纸过滤，定容至25 mL，即得金线莲样品溶液。

1.7.3 样品黄酮含量的测定 精确吸取经一定倍数稀释的样品液1.0 mL，按1.7.1 中的显色方法测定吸光度，以芦丁为标准品，根据公式y=[(A+0.0899)×K]/196.9，计算金线莲的总黄酮含量。

1.8 总生物碱含量的测定

1.8.1 标准曲线的制作 参考林丽清等报道的超声振荡法[8]。在波长418 nm进行比色，以盐酸麻黄碱质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。

1.8.2 样品液制备 精确称取金线莲样品500 mg，于锥形瓶中用50 mL pH3的酸性水溶液在功率为70 w、温度为60℃的超声条件下提取1 h，提取2次，合并提取液；提取液用氨水调节pH至10，于分液漏斗中用25 mL氯仿萃取，氯仿萃取液即为样品液。

1.8.3 样品生物碱含量的测定 精确吸取样品液1 mL，按1.8.1 中的显色方法测定吸光度，以盐酸麻黄碱为标准品，根据公式y=[(A-0.1760)×K]/175.8，计算金线莲的生物碱含量。

2 结果与分析

2.1 多糖、总氨基酸、总黄酮、总生物碱回归方程

以葡萄糖、甘氨酸、芦丁、盐酸麻黄碱为标准品，通过分光光度法分析分别得到葡萄糖、氨基酸、芦丁、盐酸麻黄碱含量的标准曲线(图1)以及金线莲多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量测定的回归方程分别为:Y=14.64X-0.0575(R2=0.9999)、Y=10.445X-0.0479(R2=0.9996)、Y=9.8450X-0.0899(R2=0.9996)、Y=8.7922X+0.1760(R2=0.9997)。

2.2 闽东野生金线莲多糖含量的比较

2.2.1 不同县野生金线莲多糖含量的比较 闽东4个县野生金线莲多糖含量测定结果如图2所示。结果表明4个产地野生金线莲多糖含量在5.61%～6.20%，周宁县最高为6.20%,表现顺序为：周宁>寿宁>柘荣>福安，总体表现出高海拔县区的金线莲多糖含量高于低海拔县区的金线莲多糖含量。

对测得的数据进行单因素完全随机试验方差分析、多重比较，方差分析可以看出：4个县野生金线莲多糖含量存在显著差异，周宁县金线莲多糖含量明显高于福安和柘荣金线莲，比福安金线莲增加10.5%，比柘荣金线莲增加7.3%，差异均达到显著水平。但周宁、寿宁两者之间无显著差异。

2.2.2 不同海拔野生金线莲多糖含量的比较 福安5个地点不同海拔野生金线莲多糖含量结果如图3所示。结果表明福安5个地点不同海拔野生金线莲多糖含量在5.60%～6.10%，总体表现出金线莲多糖含量随着海拔高度上升而上升。

对测得的数据进行方差分析、多重比较，结果表明：福安5个海拔高度金线莲多糖含量存在显著差异，海拔730、840 m金线莲多糖含量明显高于海拔420、530 m金线莲，比420 m金线莲多糖含量增加8.21%～8.93%，达到极显著差异水平；比530 m金线莲多糖含量增加6.12%～7.0%，达到显著差异水平。650 m以上3个地点多糖含量差异不显著。结果说明650 m以上海拔可能更有利于金线莲多糖的积累。

2.3 闽东野生金线莲总氨基酸含量的比较

2.3.1 不同县野生金线莲总氨基酸含量的比较 闽东4个县野生金线莲总氨基酸含量测定结果见图4。结果表明4个县金线莲总氨基酸含量在3.62%～3.95%，寿宁县最高为3.95%,表现顺序为：寿宁>周宁>柘荣>福安，表现出氨基酸含量随县区海拔高度上升呈现出先升后降的趋势。

对测得的数据进行方差分析、多重比较，结果表明：4个县野生金线莲总氨基酸含量存在显著差异，寿宁县金线莲总氨基酸含量明显高于福安和柘荣金线莲，与福安、柘荣金线莲比较，分别增加了9.1%与6.5%，达到极显著差异水平或显著差异水平；周宁县金线莲总氨基酸比福安县金线莲增加5.5%，达到显著差异水平；寿宁、周宁两者之间无显著差异。

2.3.2 不同海拔野生金线莲总氨基酸含量的比较 福安5个地点不同海拔野生金线莲总氨基酸含量结果见图5。结果表明：福安5个地点不同海拔野生金线莲总氨基酸含量在3.48%～3.71%，表现出总氨基酸含量随着海拔高度上升而上升。

方差分析、多重比较表明：福安5个海拔高度金线莲总氨基酸含量有一定差异，但各海拔高度金线莲总氨基酸含量差异不显著。

2.4 闽东野生金线莲总黄酮含量的比较

2.4.1 不同县野生金线莲总黄酮含量的比较 闽东4个县野生金线莲总黄酮含量结果见图6。结果表明： 4个县金线莲总黄酮含量在0.65%～0.82%，寿宁县最高为0.82%,表现顺序为：寿宁>周宁>柘荣>福安，表现出总黄酮含量随县区海拔高度上升呈现出先升后降的趋势。

通过方差分析、多重比较可以看出：4个县金线莲总黄酮含量存在显著差异，寿宁县金线莲总黄酮含量明显高于福安和柘荣金线莲，比福安金线莲增加26.2%，比柘荣金线莲增加12.3%，达到极显著或显著差异水平；周宁县、柘荣县金线莲总黄酮含量分别比福安县金线莲增加18.5%与12.3%，均达到显著差异水平。但周宁、寿宁两者之间无显著差异。

2.4.2 不同海拔野生金线莲总黄酮含量的比较 福安5个地点不同海拔高度野生金线莲总黄酮含量结果见图7。结果表明：福安5个地点不同海拔金线莲总黄酮含量在0.55%～0.76%，海拔730m处金线莲总黄酮含量达到最高值为0.76%，海拔840 m处金线莲总黄酮含量略有下降，在海拔420～730 m随着海拔高度上升总黄酮含量呈上升趋势。

方差分析、多重比较可以看出：福安5个海拔高度野生金线莲总黄酮含量有显著差异，海拔730、840 m金线莲总黄酮含量，比420 m金线莲增加36.3%～38.2%，比530 m金线莲增加32.7%～33.3%，达到极显著差异水平；650 m金线莲总黄酮含量比420 m处增加20%，达到显著差异水平；650 m以上3种海拔金线莲总黄酮含量无明显差异。结果表明650 m以上海拔可能更有利于金线莲总黄酮的积累。

2.5 闽东野生金线莲生物碱含量的比较

2.5.1 不同县金野生线莲生物碱含量的比较 闽东4个县野生金线莲生物碱含量结果见图8。结果表明：4个县金线莲生物碱含量在0.085%～0.098%，周宁县最高为0.098%,表现顺序为：周宁>寿宁>柘荣>福安，表现出生物碱含量随县区海拔高度上升呈现上升的趋势。

方差分析、多重比较可以看出：4个县金线莲生物碱含量存在显著差异，周宁县金线莲生物碱含量明显高于福安和柘荣金线莲，比福安、柘荣金线莲分别增加了15.3%与10.1%，差异显著；寿宁县金线莲生物碱含量比福安县金线莲增加11.8%，差异显著；寿宁、周宁两者之间无显著差异。

2.5.2 不同海拔野生金线莲生物碱含量的比较 福安5个地点不同海拔野生金线莲生物碱含量结果见图9。结果表明：福安5个地点不同海拔金线莲生物碱含量在0.062%～0.086%，海拔730 m金线莲生物碱含量达到最高值为0.086%，海拔840 m金线莲生物碱含量略有下降，在海拔420 m～730 m随着海拔高度上升生物碱含量呈上升趋势。

方差分析、多重比较可以看出：福安5个海拔金线莲生物碱含量有显著差异，海拔730 m、840 m金线莲生物碱含量，比420 m金线莲增加30.6%～38.7%，比530 m金线莲增加20.9%～28.4%，达到极显著差异水平；650 m金线莲生物碱含量比420 m、530 m金线莲分别增加20.9%与11.9%，达到显著差异水平。结果表明650 m以上海拔可能对金线莲生物碱含量的积累更有利。

3 讨论与结论

有研究表明,植物化学成分与海拔高度间显著相关[10]。至于其形成原因,普遍认为一方面与不同区域以及海拔高度的生境不尽相同有关,另一方面也与遗传背景差异有关。王峰伟[11]等研究不同海拔对颠茄产量和有效成分的影响，结果显示随海拔升高颠茄有效成分含量增加；李竹英等[12]对不同海拔高度牛蒡根营养成分分析，结果表明随着海拔的增高牛蒡根中蛋白质、氨基酸、淀粉含量增加；朱仁斌等[13]皖西山区海拔高度对西洋参有效成分的影响，结果表明总糖与还原糖含量随海拔高度的升高而增加；霍艺丹等[14]对长白山区海拔为 127～1410 m人参的氨基酸含量进行了测定, 结果表明随着海拔高度的增加,总氨基酸含量有降低也有升高,含量差别不是很大；王健等[15]对长白山地区不同海拔人参挥发油含量及其成分变化规律的研究，表明人参挥发油的含量随着种植地海拔的升高而增加；方洪生等[16]海拔高度对茶园环境及茶叶品质影响的研究，结果表明茶叶中氨基酸和咖啡碱含量均随着海拔高度的增加而增加；李磊等[17]对不同产地野生与栽培掌叶大黄中蒽醌类成分含量的比较，结果表明掌叶大黄中蒽醌类成分含量随海拔升高而升高；刘喜梅等[18]对不同海拔高度祁连圆柏叶中挥发性成分的比较，结果表明海拔高度的变化对祁连圆柏挥叶发油成分及其质量分数有一定规律性的影响。本课题对闽东不同地点、不同海拔高度金线莲有效成分研究结果与上述学者研究基本一致。闽东不同县区、不同海拔高度金线莲有效成分存在差异，估计也是遗传背景和生态因素共同作用的结果,至于闽东这些不同地理环境的金线莲遗传背景是否有真实的差异,有待进一步的研究。

闽东不同地点金线莲多糖、氨基酸含量随着海拔高度上升而上升，可能是由于海拔高度的增加,白天太阳辐射强度大，地表增温快,金线莲光合作用强,积累的光合产物多;另一方面随着海拔高度的适当增加，昼夜温差逐渐加大，有利于减少夜晚呼吸作用所引起的营养物质消耗,光合产物消耗少, 因而促进金线莲营养物质和同化产物的积累。

有研究表明，同种植物分布于不同产地或海拔高度,其次生代谢产物存在显著差异[19-20]。金线莲黄酮、生物碱属于植物的次级代谢产物，高等植物的次级代谢与初级代谢有着紧密的联系，初级代谢的许多中间产物是次级代谢的起始点，而且次级代谢受酶的调节[21]。不同地点、不同的海拔会影响氧气、光照和温度的变化，进而对次级代谢发生的过程产生影响，使得不同县区、不同海拔金线莲黄酮、生物碱含量有差异。所以不同县区、不同海拔地随着海拔高度上升多糖含量增加，而次级代谢产物黄酮、生物碱含量有增加也有减少。

多糖、总氨基酸、总黄酮、总生物碱含量是金线莲营养价值和药用价值的重要指标。本研究结果表明，海拔高的县区或海拔高的地点生长的野生金线莲多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量相对较高，因此临床用药及试验研究可以优先选择海拔相对较高地点的金线莲植物，人工栽培金线莲有条件可以选择在650 m以上的区域。本试验研究结果对进一步开发利用闽东野生金线莲资源，组织培养材料的选择以及人工栽培地点的选择等都具有重要指导意义。

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(责任编辑：柯文辉)

Contents of Functional Components in Wild Anoectochilus roxburghii from Eastern Fujian

SHI Man-rong1, GONG Lin-guang2,LU Zhi-ping1，LEI Zhong-yong1，ZHOU San-nü1

1.NingdeVocationalandTechnicalCollege,Fu′an，Fujian355000，China；2.Masteryinqualitysupervisionandinspection，Fu′an，Fujian355000，China)

Functional components and their contents inAnoectochilusroxburghiifound in the wild in the eastern Fujian regions were compared by ultraviolet spectrophotometry analysis. Four counties in the province and 5 altitudes above sea level in Fu'an were where the herbal materials collected for this study. The analysis showed that the content of polysaccharides in the samples ranged from 5.60% to 6.20%, total amino acids, from 3.48% to 3.95%, total flavonoids, from 0.55% to 0.82%, and total alkaloids, from 0.062% to 0.098%. Variance analysis and multiple comparison indicated significant differences existed in these contents among the wildA.roxburghiifrom different counties and altitudes in the area. The highest polysaccharide and total alkaloid contents were found in the samples from Zhouning County; and, those of amino acids and flavonoids, from Shouning County which was highly significantly different for those from Fu'an and significantly different for those from Zherong County. The polysaccharide content in the samples increased significantly in high altitudes. For instance, at 730 m and 840 m, the polysaccharide content was greater than that at 420 m and 530 m, at a highly significant or significant difference level. The total amino acid content increased with altitude as well, but the difference was not significant. The total flavonoids and alkaloids increased from 420 m to 730 m. At 730 m and 840 m, they were greater than those at 420 m and 530 m with highly significant differences. Over all, the contents of polysaccharide, flavonoids, and alkaloids were significantly different between below and above 650 m sea level. The differences on the contents of the 3 functional components inA.roxburghiiwere not significant at altitude beyond 650 m. The results suggested it be preferable to choose the wildA.roxburghiifrom Shouning and Zhouning County for germplasm resources, and the artificial plant tissue cultivation be located in areas above 650 m sea level, in order to foster accumulation of the active ingredients.

eastern Fujian; wildAnoectochilusroxburghii; functional components

2016-02-14初稿；2016-07-18修改稿

施满容(1965-),女，副教授,研究方向：植物与植物生理学(E-mail：shimanrong@163.com)

宁德市科研项目(20130024)；福建省教育厅科研项目(JA13441)；宁德职业技术学院科研项目(ZR2013YY04)

8567

A

1008-0384(2016)09-950-07

施满容，龚林光，周三女.闽东野生金线莲有效成分含量的比较[J].福建农业学报，2016，31(9)：950-956.

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