马 缨，殷红涛

（1.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳621006；2.四川省绵阳农业学校生物系，四川绵阳621000）

大熊猫源乳酸菌的降胆固醇作用研究

马 缨1，殷红涛2*

（1.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳621006；2.四川省绵阳农业学校生物系，四川绵阳621000）

为筛选出高效降胆固醇乳酸菌，本试验利用MRS培养基从大熊猫粪便中分离得到乳酸菌，采用磷硫铁比色法对该乳酸菌的体外降胆固醇能力进行测定，并利用经典分类法对其进行细菌学鉴定。结果表明：该乳酸菌为乳杆菌属嗜酸乳酸菌，能够耐受pH值为3的酸性环境和0.3%的胆盐，在对数生长期降胆固醇能力最强，胆固醇降低率为29.8%。

乳酸菌；大熊猫；降胆固醇

胆固醇对人体具有极其重要的生理作用，但是过高的胆固醇含量却会严重危害人体健康。与使用药物来降低血清胆固醇水平的方法比较，生物降血清胆固醇法有着较强的专一性、相对使用安全、反应条件较为温和、降解效率高等特性（张丽娜等，2007）。乳酸菌是大熊猫肠道优势菌，本试验对分离得到的乳酸菌生长特性及体外降胆固醇作用进行研究，旨在为今后益生乳酸菌及功能性乳产品的开发利用奠定一定的理论基础。

1 试验材料

大熊猫粪便采自成都动物园；MRS培养基、生理生化试验所需试剂，均为市售分析纯。

YP2002电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司生产；DL-1万用电炉，北京市永光明医疗仪器有限公司生产；DNP-9272-1A电热恒温培养箱、JB-CJ-1B净化工作台、HH-S4数显恒温水浴锅，均为金坛市晶玻实验仪器厂生产；XFS-280A手提式高压蒸汽灭菌锅、THZ-82A气浴恒温振荡器，均为金坛市医疗仪器厂生产；TD5K-Ⅱ低速离心机，长沙东旺实验仪器有限公司生产；UV-5500紫外分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司生产；麦克奥迪BA200光学显微镜，成都麦克奥迪仪器有限公司生产。

2 试验方法

2.1 MRS培养基的制备MRS培养基配方：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、酵母粉5 g、吐温-80 1 mL、无水乙酸钠5 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸二胺2 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、碳酸钙30 g，加蒸馏水至1000 mL，pH值为6.6～6.8，121℃灭菌20 min待用（管立军等，2009）。

2.2 乳酸菌的分离称取1 g大熊猫粪便样品，溶于9 mL无菌水中，振荡均匀；吸取样品0.5 mL至4.5 mL无菌水中，梯度稀释至1×10-6。取1×10-4、1×10-5、1×10-63种稀释液各0.1 mL，采用涂布法，在含3%CaCO3的MRS固体培养基上进行分离，37℃恒温培养48 h，挑选生长快、溶钙透明圈与菌落直径值较大的菌株以备用（葛红莲等，2009）。

2.3 乳酸菌降胆固醇作用的初筛将筛选的菌株接种于含2%溴百里香草酚兰的MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h，观察其颜色变化，如果变黄，则说明该菌株能够利用胆固醇产酸（刘文华等，2008）。

2.4 乳酸菌降胆固醇作用的复筛以鸡蛋黄作为胆固醇源添加到灭菌的MRS液体培养基中，混合均匀；以5%的接种量加入菌液，37℃恒温培养30 h，每隔6 h取培养液5 mL，8000 r/min离心10 min，取上清按磷硫铁比色法测定胆固醇含量（居华等，2007）。

磷硫铁比色法：取9 mL甲醇和0.1 mL发酵上清液加入离心管中，8000 r/min离心5 min；取2 mL上清液加入试管中，再沿管壁缓慢加入2 mL配制好的磷硫铁试剂，室温下放置30 min，在紫外分光光度计550 nm波长处进行比色，并记录结果。以培养时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制降胆固醇曲线。

磷硫铁试剂：称取5 g FeCl3·6H2O溶于200 mL浓磷酸中，取该溶液40 mL用浓硫酸定容到500 mL即得。

式中：C为空白对照在550 nm波长处OD值；A为菌株发酵后培养液在550 nm波长处OD值。

2.5 乳酸菌对pH值为3环境耐受力的测定将菌悬液接种于pH值为3的MRS液体培养基中，在培养0、1、2、3、4、5 h时取样，进行梯度稀释，平板法测定乳酸菌活菌数。绘制以时间为横坐标、单位菌落总数的对数值（取以10为底的对数）为纵坐标的耐酸性曲线。

2.6 乳酸菌对0.3%胆盐环境耐受力的测定将菌悬液按2%的接种量分别接种到不含牛胆盐（即空白）和含0.3%的牛胆盐的MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h之后分别测定其OD值，并按公式（胆盐耐受力/%=含有胆盐培养基的OD值/空白培养基的OD值×100）计算菌株对胆盐的耐受能力。

2.7 生长曲线的测定按5%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h，每2 h取样一次，用紫外分光光度计测定不同时间段培养液的OD值，未接种的培养液作为空白对照。绘制以培养时间为横坐标、OD值为纵坐标的生长曲线（徐晶雪等，2009）。

2.8 产酸特性的测定按5%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养24 h，每2 h取样一次，测定不同时间段菌液的pH值。将培养时间作为横坐标、pH值作为纵坐标绘制pH值曲线。

2.9 细菌学鉴定形态鉴定：将分离得到的乳酸菌接种于MRS固体培养基上，37℃恒温培养24 h，观察菌落特征；取典型菌落进行革兰氏染色，油镜下观察菌体形态。

生理生化特性鉴定：对分离得到的菌株进行过氧化氢酶、明胶水解、吲哚、硫化氢、淀粉水解、石蕊牛乳、碳水化合物发酵试验及15℃和45℃生长试验。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌的筛选

3.1.1 初筛对分离得到的乳酸菌进行初筛发现，能使指示剂变黄，初步确定其具有降低胆固醇的能力，继而可进行下一步研究。

3.1.2 复筛由图1可看出，4株菌都具有降胆固醇的能力，其中3号降胆固醇能力最强。在0～12 h所有的菌株都表现出了较高的降胆固醇能力，3号在12 h时胆固醇降低率达到了29.8%。因此选取3号菌株进行下一步研究。

图1 降胆固醇曲线

3.2 乳酸菌对pH值为3环境的耐受力食物在胃中停留时间为1～5 h，胃环境呈酸性，这就要求菌株具备一定的耐酸性。从图2可看出，在1～5 h内活菌数呈下降趋势，在2 h时活菌数最少，但其相对存活率仍然很高，由此可见，该菌株表现出了较强的耐酸性。

3.3 乳酸菌对0.3%胆盐环境的耐受力人体小肠内胆盐含量在0.03%～0.3%，益生菌在胆盐存在条件下才能吸收胆固醇，这就要求该乳酸菌还得具备一定的耐胆盐能力。经测定，四株菌的胆盐耐受力依次分别为29.3%、27.7%、30.7%、28.4%。3号菌株的胆盐耐受力为30.7%。

图2 耐受pH值为3酸性环境曲线

3.4 乳酸菌的生长曲线与产酸特性由图3可见，该菌株潜伏期较短，能迅速进入对数生长期。2～10 h繁殖速度非常快，OD值不断上升；10 h之后吸光度趋于稳定，菌株进入稳定期。结合图1可以看出该乳酸菌降胆固醇能力的大小与菌体的生长情况基本一致，潜伏期较低，对数期达到最高。

图3 生长曲线

由图4可见，0～10 h该菌株代谢速度加快，产酸量明显增加，pH值下降较快；10 h之后产酸量明显减少，几乎不再增加，pH值也趋于稳定，维持在4.6左右。

图4 pH变化曲线

对图1、图3和图4比较发现，该菌株降胆固醇能力与菌体生长情况及发酵产酸情况基本一致。潜伏期菌株降胆固醇能力低，生长缓慢，产酸不明显；对数生长期菌株降胆固醇能力最强，菌体生长最快，数量最多，产酸能力最强；稳定期降胆固醇能力和产酸能力也趋于恒定。这在一定程度上说明，该菌株的降胆固醇能力与菌体数量及环境pH值之间有着直接的关系。

3.5 细菌学鉴定

3.5.1 形态鉴定该乳酸菌在MRS平板上呈分散排列，表面较光滑、边缘整齐、中央微隆起、易于刮起，直径约0.5～1 mm的乳白色菌落，菌落周围形成明显透明圈。进行革兰氏染色后于油镜下观察，菌体形状为杆状，无芽孢，呈单个、成对或短链状排列，菌体长1.2～4 μm、宽0.5～1 μm，革兰氏染色阳性。

3.5.2 生理生化特性鉴定对该乳酸菌进行一系列生理生化鉴定，结果见表1。

表1 生理生化鉴定

通过以上细菌学鉴定结果可知，该乳酸菌为乳杆菌属嗜酸乳酸菌。

4 讨论与结论

本试验中乳酸菌对胆固醇的降解率达到了29.8%，远远高出吴慧昊等（2011）对肠球菌属乳酸菌的测定结果（25.3%）。该菌株具有高效降胆固醇能力以及生长快、耐受pH值为3酸性环境和肠道高浓度胆盐的特点，因此可应用于益生菌体外降胆固醇的研究，也可用于保健食品的开发。

在测试菌株的降胆固醇能力时，空白对照组自身也有一定程度的降解，具体原因尚不清楚，可能是因为胆固醇受到温度、氧气等环境因素的影响。

大熊猫独特的肠道微生态结构为嗜酸乳酸菌的定植提供了基础，而该菌也影响着宿主的消化生理，参与宿主体内的微生态平衡，为宿主的健康保驾护航。这也为开发利用安全性高、肠道黏附性好的益生菌提供了菌源。

[1]葛红莲，郭翠红，张军令.两株乳酸菌的分离鉴定及产酸性能的研究[J].周口师范学院学报.2009，26（2）：90～91.

[2]管立军，李艳芳，程永强，等.产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及分离鉴定[J].食品科技.2009，1：2～5.

[3]居华，刘书亮，敖灵，等.降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及生长特性[J].中国乳品工业.2007，35（8）：7～9.

[4]刘文华，任慧英，邹玲，等.一株优良乳酸菌的分离鉴定与特性研究[J].中国畜牧兽医.2008，35（2）：152～154.

[5]吴慧昊，段龙飞，张园园，等.熊猫粪便中乳酸菌的分离鉴定与降胆固醇作用研究[J].黑龙江畜牧兽医.2011，11：14～17.

[6]徐晶雪，邹积宏，袁杰利.降胆固醇乳酸菌的筛选及应用的研究进展[J].中国微生态学杂志.2009，21（6）：570～571.

[7]张丽娜，于长青.乳酸菌的降胆固醇作用及其在发酵制品中的应用[J].食品工业科技.2007，28（7）：228～230.

To screen out certain Lactic acid bacteria（LAB）that can lower the levels of cholesterol，LAB was obtained from the excrement of gaint panda with MRS medium.Cholesterol removal activity of LAB was tested by the colorimetric method with ferric chloride/sulfuric acid/phosphoric acid and identified bacteriologically by the classic classification method.The results showed that it belonged to genus lactobacillus acidophilus LAB，which was tolerant to pH 3 and 0.3% bile salts.The LAB presented a comparatively high ability of cholesterol reducing in the logarithmic growing period and its reducing rate was 29.8%.

Lactic acid bacteria；giant panda；cholesterol reducing

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161706

S816.3

A

1004-3314（2016）17-0020-03

*通讯作者