田朝晖，张 彪

（1.呼伦贝尔职业技术学院教务处，内蒙古呼伦贝尔021000；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京海淀100083）

添加剂

板蓝根、黄芪和青蒿提取物抗PRRSV作用比较

田朝晖1*，张 彪2

（1.呼伦贝尔职业技术学院教务处，内蒙古呼伦贝尔021000；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京海淀100083）

本试验对板蓝根、黄芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的作用机制进行研究。采用光学显微镜观察各细胞株形态上的变化，同时根据试验收集到的不同中草药提取物在不同浓度下（1、2、4、6 μg/mL）的细胞保护率，采用SPSS18.0软件对数据进行统计分析。分析结果表明：不同浓度的中草药提取物抑制PRRSV所导致的细胞变性效果有显著差异，浓度越高，抑制效果越好。同时，不同的中草药提取物对PRRSV的抑制效果也存在显著差异，板蓝根提取物具有一定的减少病毒造成细胞病变的作用，而青蒿素提取物保护细胞的能力效果最佳，有效降低PRRS病毒复制与抑制病毒导致细胞变性效果，阻断病毒的复制以降低感染的机会。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；板蓝根；黄芪；青蒿素；提取物；抑制

猪生殖与呼吸综合征（PRRS）为一种猪群的新兴疾病（胡梅等，2016），其致病源PRRSV属于具封套的单股正链RNA病毒，病毒大小50～65nm，基因体大小约15.1 kb，属于动脉病毒科，在临床病症上除了同时期的猪只会有呼吸道疾病发生外，对于怀孕母猪，更会有流产、早产、胎儿木乃伊化。感染后幸存的猪只也常常会引起二次感染，造成养猪业重大的损失。我国于2006年6月开始暴发高致病性猪生殖与呼吸综合征，猪的发病率达100%，死亡率为25%～50%（徐丽华等，2015）。我国的高致病性猪生殖与呼吸综合症临床征状包括高烧40～42℃、呼吸促迫、呼吸困难以及红斑性皮疹等。目前PRRSV已有商品化疫苗的上市，但是疫苗的保护力度不够，所以PRRSV至今还在全球肆虐（王君玮，2014）。

目前有少数商品化的减毒疫苗，此外也有数种不同的试验性DNA疫苗或是以杆状病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒、肠炎弧菌作为载体所发展的PRRSV单位疫苗（肖珊珊，2013），但由于PRRSV本身在宿主所诱发的免疫反应极为复杂，加上其本身又具有规避宿主免疫系统捕捉的机制，导致发展有效对抗该病的疫苗仍具有一定难度（刘依，2012）。国内有部分学者从我国传统的中草药入手，研究对抗PRRSV的抗体，这些抗病毒药物大部分为平时常见的清热解毒类中草药，研究发现，这些药物中包含的板蓝根、黄芪等对PRRSV具有一定的抗病毒作用（杨帆等，2014，王丽萍等，2013，秦华珍等，2012）。为此，本试验展开进一步研究，针对板蓝根、黄芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗PRRSV的作用机制，并对抗PRRSV效果对比分析。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒PRSSV相关的病毒细胞由中国农业大学兽医专业医学实验室保留。

1.2 板蓝根、黄纸、青蒿素等中草药活性成分的提取

1.2.1 板蓝根多糖的提取将干燥板蓝根用闭式提取器处理，所得提取液先用武火加热，沸腾后文火加热0.5～1 h，纱布过滤；药渣加10～20倍水煎煮两次，合并纱布过滤以及两次水煎煮的药液，离心、过滤、滤液浓缩至19 mL；缓缓向上述液体中加入90%乙醇至乙醇浓度为55%～65%，冷藏8～9 h，2000～4000 r/min离心15～25 min后倒去上清液，沉淀用去离子水溶解至原体积，用乙醇沉淀2次，乙醇浓度分别为65%～75%、75%～85%，沉淀用去离子水溶解至原体积，加入1/4～1/6体积8%～12%的三氯乙酸溶液充分混匀后静置3～5 min，2000～4000 r/min离心15～25 min后去沉淀得上清液，将既得上清液抽滤，烘干，即可得板蓝根多糖。

1.2.2 黄芪多糖的提取选择晾干的黄芪，粉碎后过40～80目筛，得黄芪粉，在黄芪粉中加水搅拌均匀，黄芪粉与水的重量比例为1∶5～1∶10，在水中浸泡8～16 h，加入纤维素酶，纤维素酶的添加量为0.5%～0.9%、酶解温度45℃、pH值5，将上述原料置于超声波提取设备中提取，声波的功率为400～600 W，频率为800 Hz，酶解0.1～0.5 h；再加入碱性蛋白酶和菠萝蛋白酶，碱性蛋白酶的加入量为0.2%～0.6%，菠萝蛋白酶的加入量为0.2%～0.5%，酶解温度50℃、pH值为6.8～7.5，将上述原料置于微波提取设备中提取，微波的功率为400～600 W，频率为80 Hz，酶解0.1～0.5 h，酶解后在100～105℃下灭酶5～10 min，得酶解液。将上述的酶解液置于真空浓缩器中浓缩，减压低温浓缩酶解液至原体积的1/3，得黄芪粗多糖浓缩液。在黄芪粗多糖的浓缩液中加入活性炭，活性炭占黄芪粗多糖浓缩液重量的2%～6%，搅拌0.2～0.5 h，过滤滤出活性炭，继续离心10～20 min，离心转速为4500 r/min，将上清液与沉淀分别收集，取上清液过滤去渣，过滤后得到的滤液在60～70℃下浓缩，浓缩至其浓度为60%～70%，浓缩液按1∶4的比例加入95%乙醇，沉淀静置10～20 h，离心10～20 min，离心转速为4500 r/min，收集沉淀并用乙醇反复清洗2～3次，冷冻干燥至含量为4%～6%后，再在-1～4℃下进行粉碎，得可溶性多糖。上述加酶量均为酶占超散粉碎后黄芪重量百分比。

1.2.3 青蒿素液配制将青蒿原料粉碎，过10～80目筛，按照固液比1∶5～1∶70（m/V）加入咪唑类离子液体卤化物盐和水的混合液，在超声功率1～100 W/cm2，超声频率20～80 kHz，温度20～60℃条件下，提取5～60 min，经液-固分离得到含青蒿素的提取液；将上一步得到的提取液按青蒿素提取液∶有机萃取剂比例为1∶1～20∶1（V/V）萃取1～5次，分离有机相得青蒿素萃取相，萃取相-离子液体循环使用；将得到的有机萃取相蒸发回收有机萃取剂后得青蒿素粗品；得到的青蒿素粗品再溶解，用柱层析重结晶进一步精制得高纯度青蒿素；得到的离子液体萃取液循环使用2～8次后，加入大孔吸附树脂搅拌吸附0.5～10 h，过滤或离心分离树脂，得到再生的离子液体提取液。

1.3 中药成分体外抗PRRSV效果的测定将PRRSV培养于96孔盘中（5×103cell/well)，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴附于培养盘上，60%满细胞刚好形成单层化，移除培养液，即可进行病毒效价测定。首先将待测PRRS病毒株以培养液10倍连续稀释，使病毒稀释为10-1～10-8浓度（100 L/well），每个稀释倍数进行6次重复，培养于37℃、5%CO2恒温培养箱，3 d后以倒立显微镜观察细胞病变效应（CPE）现象，即细胞在感染病毒后产生剥落、变圆、萎缩等现象。以Reed-Muench法计算细胞所产生的CPE，由此可算出病毒的TCID50（能让50%培养细胞产生CPE的病毒量）。下列公式为病毒评价的计算（王学兵等，2014）：

带入不同稀释倍数的病毒的数据，可得PRRSV的TCID50=10-4.336/0.1 mL。

1.4 细胞形态变化观察板蓝根、黄芪、青蒿素萃取物对于非洲绿猴肾脏细胞株（Marc-145）与猪肺泡巨噬细胞（PAM）形态变化观察。以血球计数盘计数后将2×l06细胞培养于6 cm有盖培养皿使细胞贴附，加入板蓝根、黄芪、青蒿素萃取物，调整浓度分别为含1、2、4、6 μg/mL，分别处理各细胞株，培养时间为1 h，病毒评价为M.O.I=2的猪生殖与呼吸综合症病毒进行感染24 h，再以光学显微镜观察各细胞株形态上的变化。

1.5 数据处理及药效评价根据试验收集到的不同中草药提取物浓度下的细胞保护率，采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，比较板蓝根、黄芪、青蒿等中药提取物的细胞保护率，从而对各中药提取物的抗病毒效果进行评价。

2 结果

2.1 中草药提取物处理并感染PRRSV对细胞形态的影响将Marc-145细胞以2×106的细胞数量培养在12孔细胞培养盘，当细胞长到七分满时分别加入1、2、4、6 μg/mL的板蓝根、黄纸、青蒿素提取物，于37℃含5%CO2细胞培养箱中作用1 h，再以病毒M.O.I=2攻毒细胞3 d，再经由显微镜观察细胞变化，主要表现为细胞折光性增加、变圆、黏连、破碎、脱落等状态。

从细胞病变的结果中可以看到，不同浓度的中草药提取物抑制PRRS病毒所导致的细胞变性效果有显著差异，浓度越高，抑制效果越好，同时，不同的中草药提取物对PRRS病毒的抑制效果也存在显著差异，板蓝根提取物具有一定的减少病毒造成细胞病变的现象，而青蒿素提取物保护细胞的能力效果最佳，有效降低PRRS病毒复制与抑制病毒导致细胞变性效果，阻断病毒的复制以降低感染的机会。

2.2 中草药提取物抗PRRSV的药效结果对比由表1可见，三种中草药提取物对PRRSV均有抑制作用，提取物的浓度越高，抑制作用越明显，不同的中草药提取物对PRRSV的抑制作用有明显差距，其中青蒿素提取物对PRRSV的抑制作用最强，而板蓝根的抑制作用一般，提取物浓度越低，不同中草药之间的抑制作用差距越明显。

表1 不同浓度中草药提取物的体外抗PRRSV作用%

3 讨论

许多中草药具有提高自身免疫力的功效，因此，安全、高效、低毒的中草药提取物日益被人们所关注。科学家们不断发现多糖以及糖复合物在生物体中不但作为能源及构成生物体的材料存在，而且它还存在于一切细胞膜结构中，参与各类细胞的生命运动，具有多样化的生物功能，如抗病毒、抗菌消炎、免疫调节、抗内毒素、抗癌等作用（王学兵等，2012）。

板蓝根为十字花植物菘蓝的干燥根，是板蓝根的主要来源。临床常用中草药，始载于《神农本草经》，味苦，性寒，有清热解毒，凉血利咽功能。用于温毒发斑、舌绛紫暗、痄腮、烂喉丹痧、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症。近年来研究证明板蓝根多糖是板蓝根提取物中含量较多、生物活性较强的一类物质。板蓝根多糖具有免疫调节功能，对特异性免疫和非特异性免疫、体液免疫或细胞免疫具有一定的促进作用。本试验研究发现板蓝根提取物对抑制PRRSV有特殊的功效，板蓝根多糖在浓度达到6 μg/mL以上时，对PRRSV的抑制作用可以达到70%以上，抑制效果明显（张红英等，2013）。

黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴。《本经》记载：“主痈疽，久败疮，排脓止痛。补虚，小儿百病。”《日华子本草》记载：“助气壮筋骨，长肉补血黄芪多糖可显著增强非特异性免疫功能和体液免疫功能，显著增强动物巨噬细胞的吞噬功能，促进血清溶血素形成，提高空斑形成细胞的溶血功能和明显的碳离廓清作用和明显增加脾重量，黄芪多糖是一种干扰素诱导剂，其抗病毒原理：刺激巨噬细胞和T细胞的功能，使E环形成细胞数增加，诱生细胞因子，促进白细胞介素诱生，而使动物机体产生内源性干扰素，从而达到抗病毒的目的。在本试验中，黄芪多糖对PRRSV有明显的抑制作用，在黄芪多糖的浓度达到6 μg/mL以上时，抑制率达到了75%以上，对PRRSV的抑制作用显著，并且黄芪多糖在各个浓度下对PRRSV的抑制作用都优于板蓝根提取物。

青蒿（Artemisia annua L.）又称黄花蒿，为菊科一年生草本植物，广泛分布于我国各地。青蒿入药最早见于马王堆三号汉墓出土（公元前168年左右）的帛书《五十二病方》，后在《神农本草经》《本草纲目》等书中均有记载，青蒿含有多种挥发性和非挥发性药用成分，其中挥发性成分主要为挥发油，非挥发性成分主要有青蒿素、青蒿甲素、乙素、丙素及青蒿酸、香豆素、黄酮、豆菌醇等（李青等，2008）。在本试验中，青蒿素抑制PRRSV的作用最显著，在各个浓度下都较显著，当青蒿素提取物的浓度达到6 μg/mL以上时，抑制率达到了85%以上，效果非常显著，本研究进一步扩展了青蒿素的用途。

4 结论

本试验对板蓝根、黄芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗PRRSV的作用机制进行研究，通过相关试验比较抗PRRSV的效果，从试验结果可以看出，三种中草药提取物对PRRSV均有抑制作用，提取物的浓度越高，抑制作用越明显，不同的中草药提取物对PRRSV的抑制作用有明显差异，其中青蒿素提取物对PRRSV的抑制作用最强，而板蓝根的抑制作用一般，提取物浓度越低，不同中草药之间的抑制作用差异越明显。试验的研究结果对治疗和预防PRRSV有一定的参考价值。

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In this test，the action of radix，astragalus and artemisinin extract against porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）and their mechanism were studied.An optical microscope was used to observe morphological changes in each cell line，and according to test cytoprotective rate collected from different concentrations（1，2，4，6 μg/mL）of herbal extracts，SPSS18.0 statistical software was used for data polarity analysis.The results showed that：the different concentrations of herbal extracts inhibiting cell degeneration by PRRS virus caused a significant difference，the higher the concentration，the inhibitory effect was better.At the same time，the effect of different herbal extracts on PRRS virus inhibitory was significantly different，radix extract had a certain reduction in viral causing cytopathic phenomenon，and artemisinin extract had the best cells protection，reduced the PRRS virus replication and inhibition effect of the virus that caused the degeneration of cells,block viral replication in order to reduce the chance of infection.

PRRSV；radix；astragalus；artemisinin；extracts；inhibition

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161705

S852.65

A

1004-3314（2016）17-0016-04

*通讯作者