任世英，邵 奎，李 雯，张 威，刘 飞

（1.淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安223003；2.淮阴工学院化学工程学院，江苏淮安223003）

科学实验研究

耐酸性α-淀粉酶产生菌的筛选及其产酶条件优化

任世英1，邵 奎1，李 雯1，张 威1，刘 飞2*

（1.淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安223003；2.淮阴工学院化学工程学院，江苏淮安223003）

为了分离得到饲料用耐酸性α-淀粉酶的菌株，从食堂排污口取土样，筛选到一株耐酸（pH=4）且产α-淀粉酶的菌株，并对其形态特征、培养特征、生理生化特征、酶学性质及产酶条件进行研究。结果表明：菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，胞内形成异染粒和PHB，接触酶、淀粉水解、卵磷脂酶试验呈阳性，反硝化试验、荧光色素呈阴性。根据菌体形态、菌落特征及部分生理生化特性，将其初步鉴定为芽孢杆菌属，即Bacillus sp.SD-1。通过单因素试验对菌株的最适产酶温度及pH进行优化，培养温度为43℃，pH为4.5，发酵60 h，酸性α-淀粉酶活力达到74.6 U/mL。

耐酸性；a-淀粉酶产生菌；芽孢杆菌属

酸性α-淀粉酶是指可在酸性条件下水解淀粉的酶，在低pH值条件下以随机方式切断淀粉分子内的α-1，4糖苷键，水解产物为低聚糖、麦芽糖和糊精等（潘涛，2010；贺胜英等，2010）。酸性α-淀粉酶广泛应用于酸性条件下淀粉原料的加工，如高麦芽糖浆的制备、发酵饮料和青贮饲料的生产、工业副产品的加工以及废料的处理等（谢建华等，2011；刘雅琴等，2010）。目前，国内外市场中常用的淀粉酶为中温、高温以及碱性α-淀粉酶，其最适pH值在6.0～10.0，在酸性条件下，其酶活性明显降低，甚至失去活性（吴茜茜，2012；李勃，2009）。随着我国淀粉质原料深加工工业的发展，工艺条件的不断改变，一些淀粉原料深加工工艺需要在较低的pH条件下进行。所以，开发新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫（魏姗姗，2014；石方方，2012）。

自从1963年日本学者Yasuji Minoda发现黑曲霉可以产生耐酸性α-淀粉酶后，人们对耐酸性α-淀粉酶进行了广泛的研究，并相继发现多种微生物如枯草杆菌、白曲霉、青霉、酵母菌均可产生耐酸性α-淀粉酶，但存在的主要问题是所选菌株的产酶活力不高以及缺乏可靠的安全性（贺胜英等，2010；洪新，2010）。

本试验从食堂排污口土壤中筛选出耐酸α-淀粉酶产生菌，并对其生长特性、生理生化特性进行研究，最后进行菌种鉴定，为耐酸性α-淀粉酶产生菌的研究提供新材料，为其在饲料工业中的广泛应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源菌株来自食堂排污口表层土样。

1.1.2 培养基筛选培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，可溶性淀粉2%，pH=4。

种子培养基和发酵（产酶）培养基：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨1.0%，CaCl2·6H2O 0.02%，MnSO40.01%，KH2PO40.05%，MgSO40.03%，FeSO4·7H2O 0.01%，pH=4。

1.2 方法

1.2.1 筛选方法取食堂排污口表层土样，称取样品10 g置于装有90 mL无菌水及数颗无菌玻璃珠的三角瓶中，剧烈振荡10 min，使样品颗粒分散均匀，静置5 min，取悬液1 mL置于灭菌平板，倒入约25 mL筛选培养基并摇晃均匀，凝固后置入37℃恒温箱培养。菌体生长后，挑取透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值较大的菌落进一步分离纯化。

1.2.2 酶活测定

1.2.2.1 粗酶液的制备将初筛得到的菌株接入种子培养基，37℃、160 r/min摇床培养24 h。种子培养液以10%的接种量接种于产酶培养基，相同条件下培养48 h，发酵液4000 r/min离心10 min，上清液为粗酶液，取上清液测定耐酸性α-淀粉酶的活性（安弋等，2010）。

1.2.2.2 酶活测定方法1%的底物溶液：称取1 g可溶性淀粉，用少量pH=5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解，然后加入到煮沸的该缓冲液中完全溶解，配制成1%、pH=5.0的淀粉底物溶液；0.005%的碘-碘化钾溶液：称取0.25 g碘、2.5 g碘化钾，用研钵研磨后用水溶解，定容至500 mL。

取10 mL的底物溶液放入一个试管中，50℃水浴保温10 min后，加入粗酶液1 mL，混匀，精确保温10 min，吸取0.5 mL混合液，加入盛有10 mL、0.1 mol/L的HCl的试管中，然后再取该混合液0.5 mL，加入盛有10 mL的碘液试管中摇匀，用分光光度计于660 nm下测定吸光值（李习等，2014）。对照管用同样的方法测定，只是将粗酶液事先于沸水中煮10 min后再加入，以蒸馏水作为比色的参比。

酶活力定义：在上述条件下，反应10 min使 1%淀粉溶液显蓝强度降低1%所需酶量为1个酶活力单位（U）（王彩澜等，2012）。

式中：D0为空白值吸光度；D为主值吸光度；100为系数，%。

1.2.3 耐酸性α-淀粉酶产生菌株部分生理生化指标鉴定参照《伯杰氏细菌系统鉴定手册》第八版测定。

1.2.4 产酶条件的优化

1.2.4.1 培养温度的优化菌株SD-1以2%接种量接种于产酶培养基，分别在34、37、40、43、50℃，pH=4，180 r/min条件下培养48 h，发酵结束后离心取上清，测定吸光度值，计算酶活性，以确定适宜产酶的发酵温度。

1.2.4.2 pH的优化菌株SD-1以2%接种量接于pH=3.5、4、4.5、5、5.5的发酵培养基，在优化好的培养温度下，180 r/min培养48 h，发酵结束后离心取上清，测定吸光度值，计算酶活性，以确定适宜的产酶pH。

1.2.5 耐酸性α-淀粉酶产生菌株的酶活曲线菌株SD-1以2%接种量接于发酵培养基，在优化好的培养温度和pH下，180 r/min培养，每10 h取样，离心取上清，测定吸光度值，计算酶活性，绘制产酶曲线。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及部分生化指标测定结果将菌株SD-1稀释涂布筛选平板，置于24℃培养箱，培养48 h，观察其菌落形态。菌落呈浅黄色，正反面颜色相同，大小为5～20 mm，表面光滑湿润，圆形，边缘整齐，形成明显的透明圈，从侧面看没有丘状突起，其部分生理生化特性见表1。

表1 菌株SD-1部分生理生化特性鉴定结果

2.2 产酶条件的优化

2.2.1 不同培养温度的影响由图1可见，在培养温度为43℃时，相对酶活较高，达到78%，所以确定菌株的较适培养温度为43℃。

图1 不同培养温度对菌株SD-1产酶活性的影响

2.2.2 pH的影响菌株SD-1接种于pH 3.5、4、4.5、5、5.5发酵培养基，在43℃、180 r/min培养48 h，发酵结束后离心取上清，测定吸光度值，计算酶活性，结果如图2所示。在pH为4.5时，相对酶活较高，达到75%，所以确定菌株的较适pH为4.5。

图2 不同pH值对菌株SD-1产酶活性的影响

2.3 耐酸性α-淀粉酶产生菌株SD-1的酶活曲线由图3可见，该菌株在60 h时，发酵液中酶活力达到74.6 U/mL，相对酶活达到最高81%，随着培养时间延长，酶活力逐渐降低。

图3 菌株SD-1的酶活曲线

3 讨论

芽孢杆菌属于益生菌，被研制成各种形式的饲料级微生态制剂应用于畜牧生产中，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）应用最广泛，是一种革兰氏阳性菌，具有耐高温、能形成芽孢、稳定性强及产酶能力强等特点（刘明超，2015）。动物摄入芽孢杆菌后，在胃肠道特定部位黏附，定植及生长，在一定程度上对病原微生物起到抑制作用，促进胃肠道微生态平衡，从而利于动物健康生长。芽孢杆菌能产生多种动物自身都不能产生的酶类，说明其作为微生态制剂具有巨大的潜力。如枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌均具有较强的分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及许多能够分解复杂的碳水化合物的酶，这些酶能够降解植物性有机化合物，同时可以降解蛋白质、甘油三酯、淀粉、果胶等营养物质，从而提高畜禽对有机物的利用率（姜芬，2016）。本试验筛选到的芽孢杆菌对酸有很好的耐受性，粗提a-淀粉酶的活性也较高，菌株对温度的耐受性也较高，需进一步对其进行改造，提高酶的活性，同时分离纯化酶，对酶的结构和特性进行研究，以期能在饲料工业得到广泛应用。

4 结论

本试验筛出一株耐酸性a-淀粉酶产生菌株，即Bacillus sp.SD-1，其最适产酶pH为4.5，最适产酶培养温度为43℃，该研究为今后淀粉酶的分离纯化提供了重要依据，后期需对该菌所产a-淀粉酶的特性进行研究，以实现其在饲料工业中的应用。

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In order to obtain acid resistant strains producing α-amylase for the application in feed industrial field. Clear circle was used to initially screen desired strains at pH 4.SD-1 was chosen as experimental strain owning to its higher ratio of dissolving circle diameter to colony diameter.Strain SD-1 was rod，G+.Test results of metachromatic granule staining，PHB，catalase，amylolysis，lecithinase were positive.Test results of denitrification and fluorchrome were negative. According to its cell and colony morphology，physiological and biochemical properties，strain SD-1 belongs to genus Bacillus，namely Bacillus sp.SD-1.Optimization of higher α-amylase production conditions：43℃，pH 4.5，fermentation for 60 h，the activity of α-amylase was up to 74.6 U/mL.

acid resistant；bacterium-producing α-amylase；Bacillus

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161703

S816.6

A

1004-3314（2016）17-0010-03

国家自然科学基金项目（51308245）；江苏省淮安市科技计划项目（HAN2015026）；江苏省生物质转化与过程集成工程实验室开放课题（JPELBCPL2013004和JPELBCPL2014006）

*通讯作者