刘明，肖自添，邱耀明，邱桂根，何焕清**

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所，广东广州510640；2.广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东广州510640；3.珠海市东大食用菌新技术研究有限公司，广东珠海519101）

茶树菇液体菌种培养基、培养条件的筛选及其应用*

刘明1，2，肖自添1，2，邱耀明3，邱桂根3，何焕清1，2**

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所，广东广州510640；2.广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东广州510640；3.珠海市东大食用菌新技术研究有限公司，广东珠海519101）

茶树菇（Agrocybe cylindracea）液体菌种的培养是工厂化生产的关键技术和发展趋势。本研究以广昌2号茶树菇作为供试菌株，通过摇瓶培养，以菌丝体生物量为指标，筛选到适合茶树菇液体培养的培养基为豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%，最适培养温度为26℃，pH值6.5；通过栽培试验发现茶树菇液体菌种栽培周期短，相比固体菌种，更适合工厂化栽培应用。

茶树菇；液体菌种；培养基；豆粕粉

茶树菇（Agrocybe cylindracea）是一种珍稀的食用菌，富含人体所需的蛋白质、氨基酸和微量元素，不仅味美且具有广泛的药理作用[1-2]。最近的研究表明茶树菇具有抗肿瘤、抗突变的活性，开发利用价值极大[3-5]。目前茶树菇的栽培主要以季节性手工作坊式为主，使用的固体菌种要经过母种、原种、栽培种三级培育后才能扩大到栽培生产环节。固体菌种因生产劳动强度大、生长周期长、污染率高等因素，制约了茶树菇的发展[5]。而液体菌种在生产时有诸多优点，例如发菌时间短、生长快速、污染率低等，因此推广液体菌种将有助于茶树菇的产量和质量的提高[6-7]。本研究主要通过对茶树菇液体菌种培养基配方、培养条件进行筛选，为应用液体菌种进行工厂化栽培茶树菇提供参考。

1　材料与方法

1.1试验菌株

茶树菇广昌2号，为本实验室保存。

1.2各种培养基制备

碳源筛选培养基，在基础培养基（蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%）中，分别加入2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4种碳源，高温高压灭菌。

氮源筛选培养基，在基础培养基（葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%）中，分别加入0.5%的蛋白胨、豆粕粉、麸皮、硫酸铵4种氮源。

培养条件优化培养基：豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。

固体菌种培养基：棉籽壳98%、麸皮1%、石膏1%。装袋1 000 g，高温高压灭菌。

栽培培养基（棉籽壳培养基）：棉籽壳94%、麸皮5%、石膏1%。装袋1 000 g，高温高压灭菌。

1.3菌种活化

将茶树菇菌种接种到PDA培养基平板，26℃恒温培养7 d，备用。

1.4碳源、氮源的筛选

将活化的菌种用直径2 mm的打孔器，接种5块到去掉琼脂粉的PDA培养液中，26℃，160 r·min-1条件下培养7 d后测定菌丝生物量。将培养好的菌种接种15 mL到筛选培养基中（500 mL三角瓶），装液量200 mL，相同条件下继续培养7 d。

1.5液体培养基不同组分配比试验

培养基中碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O各组分的浓度及其配比，按L9(34)设计四因素三水平正交试验，重复3次。试验设计见表1。

表1　正交试验因子与水平L9(34)表Tab.1Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment

1.6菌丝体生物量测定

取50 mL液体培养基用8层纱布过滤，收集菌丝后用蒸馏水洗去多余豆粕粉，干燥箱50℃烘至恒重后称量。

1.7固体菌种的制备

将活化好的菌种接种到棉籽壳培养基，在25℃左右条件下培养至满袋。

1.8起始pH对菌丝体生物量的影响

按配比试验得出的最适组合配制培养基，灭菌前用盐酸或氢氧化钠调节pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共6个梯度，重复3次，26℃、160 r·min-1条件下培养7 d后，测定不同pH对菌丝体生物量的影响。

1.9最适发酵温度筛选

在500 mL三角瓶中加入200 mL培养基，接入15 mL液体菌种，于160 r·min-1，并分别于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃条件下培养，每个温度重复3次，7 d后测定菌丝体生物量。

1.10出菇试验

将固体和液体菌种分别接种25 g或25 mL到栽培培养基中，各100袋，25℃左右培养至满袋，在26℃、相对湿度85%～90%条件下出菇两茬，记录相关信息。

1.11数据处理

数据处理使用Microsoft Excel 2007和SPSS Version 21软件。

2　结果与分析

2.1茶树菇液体菌种培养基配方筛选结果

2.1.1不同碳源对茶树菇菌丝体生长的影响

以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4种不同碳源，研究碳源对茶树菇液体菌种生长的影响，在各培养基中培养7 d后测定菌丝生物量，见表2。

表2　碳源对茶树菇液体培养的影响Tab.2Effect of different carbon source on the mycelial growth of Agrocybe cylindracea

由表2可见，茶树菇菌丝在葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉3种碳源条件下，生物量差异不大，表明茶树菇对碳源的利用较广。但在以蔗糖作为碳源的培养基上生物量相对较低，明显低于其他3种碳源。

2.1.2不同氮源对茶树菇菌丝体生长的影响

在基础培养基中分别加入蛋白胨、豆粕粉、麸皮、硫酸铵4种氮源，不同氮源对茶树菇液体培养的影响见表3。

表3　氮源对茶树菇液体培养的影响Tab．3Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of Agrocybe cylindracea

从表3中可以看出，不同氮源对茶树菇的生物量有明显影响。在有机氮中，以蛋白胨和豆粕粉最好，其次是麸皮，在以硫酸铵为氮源的液体培养基中茶树菇菌丝体生物量最低。说明茶树菇对有机氮的利用率较高，而对无机氮的利用率偏低。

2．1．3培养基不同组分配比试验结果

选用豆粕粉为氮源，葡萄糖为碳源，以MgSO4和KH2PO4为无机盐进行L9(34)正交试验，其结果见表4。

表4　正交试验结果Tab．4Results of the L9(34)orthogonal experiment

根据表4极差值（R）比较，四个因素对菌丝体生物量的影响大小依次为A＞B＞D＞C。根据各因素各水平菌丝体的生物量，茶树菇液体培养基理论最优水平组合为A2B3C2D2，即豆粕粉0．4%、葡萄糖2%、MgSO40．1%、KH2PO40．1%。

2.2茶树菇液体菌种培养条件筛选

2．2．1不同起始pH对菌丝体生物量的影响

采用筛选得到的培养基配方，研究起始pH对茶树菇液体菌种发酵的影响，结果见图1。

由图1可见，茶树菇对pH的适应范围较广，在液体培养基中pH5．5～8．0时菌丝生长较好，起始pH为6．5时菌丝体生物量最高。

2．2．2培养温度对菌丝体生物量的影响

为了找出茶树菇液体菌种发酵的最佳发酵温度，采用筛选得到的培养基，在不同温度下进行发酵实验，结果见图2。

图1　起始pH对茶树菇菌丝体生物量的影响Fig．1Effects of initial pH on mycelial growth in shake flask cultures of Agrocybe cylindracea

图2　培养温度对茶树菇菌丝体生物量的影响Fig．2Effects of temperature on mycelial growth in shake flask cultures of Agrocybe cylindracea

由图2可见，茶树菇在液体发酵过程中，培养温度为26℃时菌丝体生物量最高，在高于26℃后菌丝生物量趋于平缓。

2.3液体菌种的应用

为了确定最佳培养时间，应用筛选得到的培养基配方和条件，将经过6 d、7 d、8 d培养的液体菌种接种到棉籽壳培养基上后，观察菌丝生长情况，结果见表5。

表5　茶树菇液体和固体菌种出菇比较Tab.5Comparison of fruiting condition of Agrocybe cylindracea between liquid culture and solid culture

菌丝长满袋平均天数分别为18 d、15 d、16 d。培养7 d的菌种萌发时间最短，长满袋所需时间最短，长势旺盛。记录同时接种固体菌种和液体菌种的菌袋生长过程，发现液体菌种栽培袋长满菌袋时间相比固体菌种提前15 d左右，头潮菇采收提前8 d左右。

3　小结

在食用菌的液体培养中，碳源、氮源和矿物质元素影响菌丝生长。通过对茶树菇液体菌种培养过程中营养因子对生物量的影响研究，发现以葡萄糖为碳源，培养基的效果较好，这与苗秉义[8]的结果一致。在最佳氮源的选择上，蛋白胨和豆粕粉的差异不显著，但豆粕粉来源广泛且价格低廉，可应用于大规模的生产。在此基础上进行培养条件的优化得出最佳的培养基配方为豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。发酵培养基的pH值，对食用菌生长具有非常明显的影响，也是影响培养过程中各种酶活性的重要因素。本研究发现茶树菇广昌2号对pH值的适应性较广，在初始pH5.5～8.0条件下都能正常生长；在pH6.5时菌丝生物量最大，这与刘竞男等[9]和曾泽彬等[10]的研究结果基本一致，而与Kim HO[11]等的结果略有差异，可能是由于选择的菌种不同而引起的。温度是食用菌生长相对敏感的因素。试验发现茶树菇广昌2号在26℃液体培养的菌丝体生物量最大。液体菌种相比固体菌种在大规模生产上有明显优势。通过出菇试验，液体菌种菌丝长满栽培袋的时间为17 d，相比固体菌种缩短了15 d的时间，头潮菇出菇时间也有所减少；生物转化率与固体菌种相比没有明显差异，说明使用液体菌种能缩短栽培周期，可以应用于工厂化生产。

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Optimization and Application on Liquid Spawns Cultivation Medium of Agrocybe cylindracea

LIU Ming1,2,XIAO Zi-tian1,2,QIU Yao-ming3,QIU Gui-gen3,HE Huan-qing1,2
(1.Vegetables Research Institute Guangdong Academy of Agriculture Sciences,Guangzhou 510640,China; 2.Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables,Guangzhou 510640,China; 3.Dongda Mushroom New Technology Research Company Limited,Zhuhai 519101,China)

Liquid spawn cultivation was the key technology and developmental trend for Agrocybe cylindracea production.The optimization of nutritional requirements was studied for the mycelial biomass of A.cylindracea guangchang-2 in a shake flask culture.The optimum concentration of each medium component was determined using the orthogonal matrix method.The optimal combination of the media constituents for mycelial growth was as follows:soybean meal 0.4%,glucose 2%,MgSO40.1%, KH2PO40.1%.The optimal temperature was 26℃and initial pH was 6.5.Producing experiments showed use liquid spawn has shorter cultivation period and better for industrial application.

Agrocybe cylindracea;liquid spawn;cultivation medium;soybean meal

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0039-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.010

广东省农业科学院蔬菜研究所所长基金项目（所-201405）；广东省“三区”科技人才选派和培养项目（2015A020224015）；佛山市顺德区产学研合作项目（2014CXY16）。

刘明（1984-）男，博士，助理研究员，主要从事食用菌遗传与育种研究。E-mail:liuming2021@163.com

**通信作者：何焕清（1964-），男，本科，研究员，主要从事食用菌栽培与推广研究。E-mail:hhq407@sina.com

2016-05-29