冯君平++谢澎++孙一枚++陈作江++杨明++李国晏

摘要：目的 探索A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产中奈瑟脑膜炎双球菌传代培养的最适培养基。方法 用BD代替酸水解酪蛋白制备相应的培养基，传代培养4～5 h，以收获菌体量来确定较好培养基配比。结果 BD用于A群C群奈瑟脑膜炎菌培养细菌数高，能稳定提高奈瑟脑膜炎双球菌的产量。结论 BD可作为A群C群奈瑟脑膜炎双球菌培养的最适培养基。

关键词：BD；奈瑟脑膜炎双球菌；培养菌数

The Study about BD in the Medium of Neisseria Menigitids

FENG Jun-ping， XIE Peng，SUN Yi-mei，CHEN Zuo-jiang YANG Ming， LI Guo-yan

（Lanzhou Institute of Biological Products Co.，Ltd ， Center for Gansu Provincial Vaccine Engineering Research，Lanzhou730046，Gansu，China）

Abstract：Objective To explore the optimal medium for culture of the meningococas polysaccharide vaccine.Methods The caseinic acid of BD medium was changed， The Neisseria meningitids was cultived for four-five hours. And the bactertrial to determine the best formulation of the medium was harvested .Results The caseinic acid of BD medium have the advantages of good culture. Conclusion The caseinic acid of BD medium is one of good formulation mediums in cultiving Neisseria meningitids .we should exchange the chemical composition of medium with the Bacterium changed.

Key words：Caseinic acid of BD；Neisseria menigitids ； Bacterial concentration

流行性脑膜炎是由奈瑟脑膜炎双球菌引起的急性呼吸道传染病。该病传染性强，起病急，病情发展快和病死率高等特点。我国在大规模疫苗接种后，大大降低流脑的发病率[1]。随着流脑在病原方面变化[2]，须接种A+C群流脑多糖疫苗来预防流脑的流行。为了选择培养脑膜炎双球菌最适宜的培养基，本实验采用调整某些培养基成分来观察细菌培养结果。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1培养基 基础培养基：酵母浸出粉（生物级）0.2%；磷酸二氢钾（AR）0.02%；磷酸氢二钠（AR）0.1%；氯化铵（AR）0.125%；甘氨酸（AR）0.01%；L-谷氨酸钠（AR）0.1%；硫酸镁（AR）0.06%；葡萄糖（AR）1%。

酸水解酪蛋白：A：法国Solabia 2.2%，批号：5042767识别码Y120150158，有效期：2019年12月31日；B：美国BD：1.32%，批号：4195668，有效期：2019年05月；C：50%盐酸水解酪蛋白液（自制）：1.2AN%，批号：20080309，有效期：2013年3月23日。

实验组：S（1）号培养基：基础培养基+酸水解酪蛋白（法国Solabia）；BD（2）号培养基：基础培养基+酸水解酪蛋白（BD）；Y（3）号培养基：基础培养基+50%盐酸水解酪蛋白液（自制）。

1.1.2菌种 试验用脑膜炎球菌的菌号：A群：CMCC 29201 （A4）菌株；C群：CMCC 29205（C11）菌株。来自中国生物制品研究院。

1.1.3反应罐 培养基制备罐：型号：MPS30L Applikon 30L Holland

1.2方法

1.2.1培养基制备[3-7] 开启全自动配制罐，按1.1.1项配方制备基础培养基和实验组培养基，在适宜的配制温度，搅拌转速下溶解。澄清过滤分装待用。

1.2.2菌种传代培养 将A群和C群菌种开启后，接种于10%羊血琼脂培养基上，35～37℃，CO2环境培养12～20 h，刮取镜检合格菌苔接种于脑膜炎球菌多糖疫苗培养基扩增8～12 h后同上法转种于发酵罐（30 L）。

1.2.3细菌的发酵培养及浓度的测定和形态观察 培养中取样测定细菌浓度及革兰染色显微镜观察，了解细菌生长情况，并适时调整各项参数。

2结果

按照流脑深层培养工艺培养[8]：

2.1不同配方培养基中培养基渗透压比较 从表1可见，在A群和C群的培养基中，配方1的渗透压高于配方3的渗透压，配方2的渗透压不高于前两者，同种配方培养基渗透压基本相同。

2.2不同配方培养基中细菌复苏生长情况 从表2可见，按同一浓度接种，在相同的培养条件下：随着培养时间的延长，配方3培养的细菌数量增加缓慢；而配方1和配方2培养的细菌数量迅速增长，配方2的细菌数增长速度快于配方1；提示配方2更有利于A群和C群脑膜炎球菌细菌生长。

2.3 不同工艺下细菌复苏情况比较 从表3中表明：在A群或C群的培养中，（BD）酸水解酪蛋白培养基采用高压灭菌或除菌过滤两种工艺中差异不明显，都能用于培养基制备。复苏该菌时除菌过滤的成功率略高于高压灭菌，P<0.05。说明除菌过滤后的培养基成分较能有效的复苏脑膜炎球菌。

2.5培养基成分中氨基氮与氯化钠的比较。

3讨论

在进行微生物的培养中，适宜的培养基成分，能有效的提供细菌生长所需的碳源，氮源等营养。奈瑟脑膜炎球菌多糖疫苗原液体培养基是经典的配方，但随着细菌传代次数的增多及一些理化性状的变化，原配方有时不能适应新的培养。这次研究表明流脑的培养基成分中改良的酸水解酪蛋白（BD）能为细菌提供蛋白质、多肽、核苷酸、充足的游离氨基酸、维生素B族及生长因子等，这些成分有利于细菌传代生长发育。这种试验既有利于提高培养基质量又有利于培养基的商品化生产。

参考文献：

[1]胡绪敬，流脑流行的检测与预防[J].中国公共卫生，2004，20（5）：638-640.

[2]卫生部.2006年全国法定传染病疫情.[EB/OL]卫生部，中华人民共和国.http：//www.chinadcn.net.cn/c272442/n272530/n272757.16423.html.

[3]陈天寿，主编.微生物培养基制造与应用[M].第1版.北京：中国农业出版社，1995.

[4]纪绍梅，主编.微生物培养基质控与图解[M].第1版.北京：北京科学技术出版社，2006.

[5]李国宴，孙一枚，杨勇，等.脑膜炎奈瑟氏菌培养结果与培养基质量指标的关系研究[C].第十次全国生物制品学术会议论文汇编，2009：119-122.

[6]杨建勇，刘梅影，林云，等.W135群脑膜炎球菌发酵工艺的研究[J].微生物学免疫学进展，2005，33（30：19-24.

[7]李国宴，孙一枚，吴卫坚，等.脑膜炎球菌多糖疫苗培养基的标准化研究[J].微生物学免疫学进展，2012，40（2）：26-29.

[8]中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程2000版[S].化学工业出版社，2000：249-250.

编辑/孙杰