樊雯娟，代立勤，刘新智

（1.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉　831100；2.昌吉州农产品检验检测中心，新疆昌吉　831100）

高效液相色谱-柱后衍生法检测牛奶中10种氨基甲酸酯类农药残留

樊雯娟1，代立勤2，刘新智1

（1.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉831100；2.昌吉州农产品检验检测中心，新疆昌吉831100）

通过建立固相萃取-高效液相色谱柱后衍生法，同时测定牛奶中10种氨基甲酸酯类农药（涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威及仲丁威）残留。样品经乙腈提取，HLB固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱-柱后衍生法进行测定，对每种农药进行了3种不同浓度（100，200，400 μg/kg）的添加回收率试验。结果表明，10种农药的回收率在70.2%～96.7%，相对标准偏差为3.37%～6.27%。试验中所建立的10种农药测定方法完全可以满足当前农药残留分析的要求。

高效液相色谱-柱后衍生；牛奶；氨基甲酸酯类农药残留

氨基甲酸酯类农药（NMCS）产量大、种类繁多，广泛用于杀虫、杀螨、杀线虫等方面。除呋喃丹、涕灭威属高毒，西维因、异丙威、速灭威属中等毒性，其余均属低毒［1］。大多数品种对高等动物毒性较低，是一种高效、低毒的广谱杀虫剂［2］。目前，其残留检测方法在蔬菜瓜果中探索较多［3］，虽然在动物性食品中有相关检测报道［4］，但方法开发较农产品少。而此类农药滥用问题一直存在，过量使用不仅危害农产品安全，还会造成环境污染，并通过食物链的传递，在动物性食品中二次污染，进而危害人体健康，所以近年来也受到广大消费者的极大关注［5］。

已有文献报道采用液质联用仪检测牛奶中的残留问题［6］，但是液质联用仪及其分析检测方法所用耗品价格十分昂贵，很多基层检测实验室没有条件配备，而高效液相色谱仪相比成本较低，基层检测实验室普及率较高。高效液相色谱-柱后衍生法检测氨基甲酸酯类农药残留具有重现性强、灵敏度高、选择性强等优点［7］，用其检测牛奶中的氨基甲酸酯类农药还少有报道。所以，本文在使用高效液相色谱-柱后衍生法的同时检测牛奶中10种氨基甲酸酯类农药残留，既扩大了基层检测实验室的检测范围，又有效降低试验成本。

1　试验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司产品；Agilent 1260型荧光检测器，安捷伦科技有限公司产品；SSI/LabAlliance Z0041050型柱后衍生装置，天津市兰博实验仪器设备有限公司产品；METTLER TOLEDO AL204-IC型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司产品；IKA RV10型旋转蒸发仪，广州仪科实验室有限公司产品。

乙腈（AR），天津市光复发展科技有限公司产品；乙腈（HPLC，CNW）、甲醇（HPLC，CNW）、氯化钠（AR）、四硼酸钠（AR）、巯基乙醇（AR），天津市致远化学试剂有限公司产品；邻苯二甲醛（＞99.0%），阿拉丁试剂上海有限公司产品；HLB固相萃取柱（CNW）、10种标准溶液（纯度＞99%），农业部环境保护科研监测所产品。

博美牧场的鲜牛奶，将样品放入聚乙烯瓶中并贴标签，于-20～-16℃保存。

荧光衍生试剂的配制（0.05 mol/L NaOH溶液）：称取2.0 g氢氧化钠用纯水溶解并定容至1 000 mL，过滤。OPA试剂：称取19.1 g四硼酸钠纯水溶解于1 000 mL纯水中，完全溶解后过滤备用；称取0.050 g邻苯二甲醛溶于5 mL甲醇（HPLC级）中，混匀备用。将上述配好的试剂混匀后，加入0.050 mL的巯基乙醇放入棕色的试剂瓶中，现配现用。

1.2试验方法

1.2.1色谱条件

（1）液相色谱柱。Agilent ZORBHX Eclipse SBC18型柱，150 mm×4.6 m，粒度5 μm；流动相为甲醇、水进行梯度洗脱程序；柱温42℃；进样体积20.0 μL；荧光检测：λex330 nm，λem465 nm；以外标法定量，保留时间定性。

（2） 柱后衍生条件。0.05 mol/L氢氧化钠溶液、OPA衍生试剂经0.45 μm微孔滤膜真空过滤，均以0.3 mL/min的流速；衍生池温度90℃。

1.2.2农药标准溶液配制

准确取各农药标准品50 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，使用时现配现用。

1.2.3样品前处理

将牛奶样品解冻后，称取10.00 g（精确到0.01 g）于50 mL的聚乙烯离心管中，加入20 mL乙腈涡旋混匀1 min，然后超声提取10 min，过滤提取液到另一聚乙烯离心管中，管内加入4～5 g NaCl，再次涡旋混匀后静止至少30 min，使水层与乙腈层分开。吸取乙腈层10 mL转移到氮吹管中，35℃吹至近干，残渣用2 mL甲醇溶解后用2 mL水稀释后待净化；HLB固相萃取小柱用6 mL甲醇，6 mL水预洗，然后将4 mL提取液过柱，重复操作1次，再分别用6 mL水，6 mL 5%甲醇淋洗，弃去淋洗液，最后用8 mL甲醇分2次洗脱，收集所有洗脱液到氮吹管中于35℃吹干，后用2.5 mL 50%甲醇涡旋溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

2　结果与分析

2.1梯度洗脱程序的选择

试验采用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水3种流动相体系进行梯度洗脱分离，试验结果表明，甲醇-水、乙腈-水2种流动相体系对目标物的分离效果较好，甲醇-乙腈-水的流动相体系对目标物的分离效果难以达到预期效果。纵观甲醇、乙腈与水的流动相体系，甲醇-水分离效果更好，同时因为乙腈毒性较强，故采用甲醇-水的流动相体系。

梯度洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序

10种农药的典型色谱见图1。

图1　10种农药的典型色谱

按照设定好的色谱条件和流动相洗脱条件进行试验，发现在25 min内，涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威10种农药能被很好地分离开。

2.2萃取剂的选择

氨基甲酸酯类农药在蔬菜、水果、谷物及动物性来源食品中一般使用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、甲苯作为提取溶剂。牛奶样品与蔬菜等日常做的样品区别很大，牛奶样品含有比较多的蛋白质和脂肪类物质，所以在提取过程中要考虑除蛋白，后续要考虑盐析作用分层。对比不同提取试剂发现，乙腈是最佳选择，因为乙腈对提取氨基甲酸酯类农药效果较好，还能起到让蛋白质沉淀的作用，给后续的处理带来方便。

2.3SPE小柱的选择

采用不同SPE小柱对10种氨基甲酸酯类农药回收率的影响见表2。

表2　采用不同SPE小柱对10种氨基甲酸酯类农药回收率的影响

将样品进行初步的分离萃取之后，仍然有其他杂质也一并被乙腈提取出来，干扰了目标组分，降低了检测灵敏度，所以需要使用SPE小柱对目标组分进行净化。本试验分别选取HLB柱、NH2柱、C18柱进行分离净化试验，从试验结果可以发现使用HLB柱对于净化牛奶样品效果最好，回收率在80%以上；其次是NH2柱；使用C18柱时，杂质不能很好净化掉造成干扰峰使部分目标组分回收率偏低。这是由于HLB聚合物表面有亲水性和疏水性集团，具有良好的水浸润性，特别是对极性化合物，相对保留容量较传统硅胶基质SPE高，所以首选HLB柱。

2.4标准曲线、线性范围及定量限

10种农药的线性方程及其相关系数和方法的检出限见表3。

表3　10种农药的线性方程及其相关系数和方法的检出限

由表3可知，在0.1～1.0 μg/mL范围之内10种氨基甲酸酯类农药均具有良好的线性关系，检出限均在8.0～20.0 μg/kg，可以满足实际牛奶样品中此10种农药的检测。

2.5方法的回收率和实际样品的测定

在牛奶样品中添加100，200，400 μg/kg 3个浓度的10种氨基甲酸酯类农药混合标准样品，对每组样品进行6次测定，计算其平均回收率及其精密度。

牛奶样品中10种氨基甲酸酯类农药平均回收率和相对标准偏差见表4。

由表4可知，10种农药的平均回收率在70.2%～96.7%，相对标准偏差为3.37%～6.27%，说明该方法精密度较好，前处理和仪器条件都较稳定，满足多种残留农药的分析要求。

2.6实际样品的测定

按照上述方法检测了博美牧场的散称牛奶10份，结果10种农药均未检出。

3　结论

建立了高效液相色谱-柱后衍生法检测牛奶中10种氨基甲酸酯类农药残留的方法，用于牛奶中农药残留测定达到令人满意的检测效果，具有操作简便、快捷准确、污染小、成本低等特点，极大地缩

表4　牛奶样品中10种氨基甲酸酯类农药平均回收率和相对标准偏差

短了检测时间，节省了资源，扩大了基层检测实验室的检测范围并有效降低了试验成本。

［1］文君，孙成均，缪红，等.高效液相色谱法同时测定蔬菜中5种氨基甲酸酯类农药 ［J］.中国卫生检验杂志，2007，17（6）：964-966.

［2］邵金良，黎其万，刘宏程，等.高效液相色谱法测定蔬菜中8种氨基甲酸酯类农药残留 ［J］.现代食品科技，2011，27（7）：856-860，869.

［3］廖杰良，李拥军，熊文明，等.高效液相色谱法对蔬菜中7种氨基甲酸酯农药残留的测定 ［J］.现代农业科技，2014（7）：152-153.

［4］吴刚，王华熊，俞春燕，等.加速溶剂萃取-GPC液相色谱柱后衍生化测定动物源性食品中多种氨基甲酸酯类农药残留量 ［J］.中国食品卫生杂志，2008，20（5）：409-413.

［5］刘慧玲.牛奶中农药残留前处理研究进展 ［J］.食品质量安全检测学报，2014，5（5）：1 419-1 426.

［6］田宏哲，赵瑛博，周艳明.高效液相色谱-质谱法测定牛奶中6种氨基甲酸酯农药残留 ［J］.食品科学，2011，32（2）：187-190.

［7］李海飞，李静，徐国锋，等.HPLC快速分析水果中氨基甲酸酯农药残留量 ［J］.分析实验室，2009（S1）：48-50.◇

Determination of Ten Carbamates Residues in Milk by HPLC with Postcolumn Derivatization

FAN Wenjuan1，DAI Liqin2，LIU Xinzhi1
（1.Inspection and Testing Center for Agricultural Products Quality and Safety of Changji City，Changji，Xinjiang 831100，China；2.Inspection and Testing Center for Agricultural Products of Changji State，Changji，Xinjiang 831100，China）

A solid phase extraction and high-performance liquid chromatography（HPLC）method with postcolumn derivatization is developed for the analysis of ten carbamates（aldicarb sulfoxide，aldicarb sulfone，methomyl，3-hydroxycarbofuran，aldicaryl，metolcarb，carbofuran，carbaryl，isoprocqrd，fenobucarb） residues in milk.The sample is extracted by acetonitrile and cleaned up with HLB solid-phase extraction.Then the concentration of ten carbamates residues is determined by HPLC with postcolumn derivatization.At the spiked level 100，200，400 μg/kg respectively，the average recovery for the ten carbamates is 70.2%～96.7%，and the relative standard deviation are between 3.37%and 6.27%.The proposed method can meet the current requirements for the analysis ten carbamates residues.

high performance liquid chromatography-postcolumn derivatization；milk；carbamate pesticide residue

TQ45

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.038

2015-10-26

樊雯娟（1983— ），女，硕士，农艺师，研究方向农产品质量安全检测。