代能捷，杨全伟，程　璐，黄文涛

(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉　430022)



高效液相色谱法测定痛风颗粒中落新妇苷的含量

代能捷*，杨全伟，程璐，黄文涛#

(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉430022)

目的：建立测定痛风颗粒中的落新妇苷含量的方法。方法：采用Waters e2685 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)，检测波长为290 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μl。结果：落新妇苷进样量在0.099 8～0.998 0 μg(r=0.999 9)范围内与峰面积线性关系良好；精密度试验、重复性试验、稳定性试验的RSD均≤3.00%；平均加样回收率为101.54%，RSD=0.54%(n=6)。结论：本研究测定方法准确、稳定、简便，可用于痛风颗粒的质量控制。

痛风颗粒； 落新妇苷； 高效液相色谱法

痛风颗粒为武汉市第一医院应用多年的具有良好降尿酸作用的临床经验方。痛风颗粒由土茯苓、白英、薏苡仁、徐长卿等11味中药制成，具有淡渗利湿、健脾祛浊、通脉补肾的功能，主治由高尿酸血症引起的痛风。土茯苓为方中君药，查阅文献可知土茯苓中主要有效成分为落新妇苷，是二氢黄酮类化合物[1-3]。本研究建立了高效液相色谱法测定痛风颗粒中落新妇苷的方法，以期为该制剂的质量控制提供有效依据。

1　材料

1.1仪器与设备

Waters e2695型高效液相色谱仪，Waters 2489型紫外检测器(美国沃特斯公司)；百万分之一天平[赛多利斯(上海)贸易有限公司]。

1.2药品与试剂

落新妇苷对照品(中国食品药品检定院，批号：111798-201504)；痛风颗粒(武汉市第一医院制剂中心，批号：20150614)；甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

Waters e2685 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)；检测波长为290 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μl。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液：精密称定4.990 0 mg落新妇苷对照品，加入50%甲醇溶液溶解并稀释至50 ml，摇匀，即得对照品溶液，溶液浓度为0.099 80 mg/ml。

2.2.2供试品溶液：精密称定样品0.50 g，加入50%甲醇溶液50 ml，称质量，超声溶解30 min，放冷，称质量，补液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液：取不含土茯苓的样品，按照“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3检测波长的选择

取“2.2.1”项下对照品溶液，采用紫外分光光度法进行全波长扫描，测定结果显示，最大吸收波长为290 nm。因此，本研究以290 nm作为检测波长[4-5]。

2.4专属性试验

取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，供试品溶液液相色谱图中落新妇苷的色谱峰能够较好的分离，且阴性对照溶液液相色谱图在相同保留时间无色谱峰出现，表明本研究方法专属性良好，见图1。

A. 对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照品溶液A. Control solution; B. Test solution; C. Negative control solution图1　高效液相色谱图Fig 1　HPLC chromatogram

2.5线性关系考察

精密称取“2.2.1”项下对照品溶液1、2、4、6、8、10 ml，置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，分别制备成质量浓度为0.009 98、0.019 96、0.039 92、0.059 88、0.079 84、0.099 80 mg/ml的溶液，分别精密10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以落新妇苷的质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到回归方程：Y=2 336 982X-114 709，相关系数r=0.999 9。结果表明，落新妇苷在0.099 8～0.998 0 μg范围内线性关系良好。

2.6精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果表明，落新妇苷峰面积的RSD=0.53%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7重复性试验

称取样品适量(批号：20150614)，共6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。外标法计算落新妇苷的平均含量为0.039 20 mg/ml，RSD为1.21%，表明本方法重复性良好。

2.8稳定性试验

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液，于室温(25 ℃)下放置0、1、2、4、8、12 h时，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，落新妇苷峰面积的RSD为0.69%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.9加样回收率试验

精密称取已知含量的样品(批号：20150614)，每份0.25 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，依次精密加入落新妇苷对照品(落新妇苷质量浓度：0.040 90 mg/ml)10 ml，对其加样回收率进行测定，见表1。计算分析可得，平均加样回收率为101.54%，RSD=0.54%，结果显示本次试验方法加样回收率良好。

表1　加样回收率结果Tab 1　Results of recovery tests

2.10样品含量测定

取3批痛风颗粒(批号：20150615、20150616、20150617)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件测定落新妇苷的含量，见表2。

表2　样品含量测定结果(mg/g)Tab 2　Content determination of samples(mg/g)

3　讨论

药效学研究结果证明，黄酮是药品治疗高尿酸血症的主要有效部位[6-9]。其中，落新妇苷能够抑制过氧化物酶的活性，清除次氯酸，增强机体抗氧化能力，从而起到降尿酸作用[10]。

有文献表明，高效液相色谱法测定土茯苓中落新妇苷的含量，流速、柱温等色谱条件对保留时间、分离度、影响不大[11-14]。也有文献报道，在复方土茯苓颗粒的提取工艺筛选中，采用落新妇苷作为考察指标，方法稳定可行[15]。

本研究表明，落新妇苷在290 nm处有最大吸收波长，故设定其为检测波长。在流动相选择上，考察了不同比例的甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸分别作为流动相，结果表明，甲醇-水作为流动相时，落新妇苷拖尾现象较为明显。因此，本研究以甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)作为流动相，其基线平稳，落新妇苷与杂峰具有较好的分离度，且无明显拖尾现象。

综上所述，本研究结果准确、方便稳定，可用于痛风颗粒中落新妇苷的检测，弥补了痛风颗粒质量控制标准中含量测定的空白，从而在生产环节保证痛风颗粒的有效性和稳定性，保障患者用药的安全与有效。

[1]刘佳，李玲.高尿酸血症的发病机制与药物治疗研究进展[J].国际药学研究杂志，2010，37(1)：24-28.

[2]张笑颜，詹丽茵，曾祥腾.高效液相色谱法测定不同产地土茯苓药材中落新妇苷的含量[J].中国医药导报，2010，7(10)：90-91.

[3]曾瑞鑫，赵钟祥，林朝展，等.HPLC法测定过岗龙中落新妇苷的含量[J].中国药师，2012，15(6)：762-764.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：18.

[5]邵丰，温成平，丁兴红.基于RPLC技术测定祛浊通痹方中落新妇苷含量[J].中国中医药信息杂志，2012，19(2)：47-48.

[6]Tang J，Guo J，Fan J，et al.Metabolite profiling of astilbin in rat sera using UPLC/MSE and impact of its metabolites on immuno-suppressive activity[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，929：56-62.

[7]臧路平，刘志刚，吴新荣.泄浊除痹方总黄酮体外对尿酸吸收的影响及分子机制探讨[J].中药材，2011，34(11)：1763-1765.

[8]王敏，胡梦梅，陈文龙，等.响应面法优化土茯苓总黄酮的提取工艺[J].江西中医药，2014，45(11)：60-63.

[9]方圆，王雪彦，晁若冰.土茯苓药材中落新妇苷和总黄酮的含量测定方法研究[J].药物分析杂志，2010，30(9)：1738-1741.

[10]黄敬群，朱妙章，王四旺.染料木素、芹菜素、槲皮素、芦丁和落新妇苷对高尿酸血症小鼠黄嘌呤氧化酶活性及血清尿酸水平的影响[J].中国药理学通报，2011，27(4)：561-565.

[11]徐硕，尚明英，刘广学，等.高效液相色谱法测定土茯苓药材中7种活性成分的含量[J].中国中药杂志，2015，40(3)：469-479.

[12]孙兢喆.高效液相色谱法测定土茯苓中落新妇苷、阿魏酸、白藜芦醇含量[J].陕西中医，2015，36(1)：103-104

[13]刘志刚，曾祥腾，孙维峰，等.正交试验优化土茯苓黄酮类成分提取工艺研究[J].中华中医药导刊，2010，28(3)：466-468.

[14]方婧，付梅红，杨洪军，等.微波协助提取在中药饮片含量测定中的应用(3)——微波法与药典法测定土茯苓中落新妇苷含量比较[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(24)：43-45.

[15]刘伟，刘志刚，孙维峰，等.Box-Behnken效应面法优化复方土茯苓颗粒提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(10)：16-19.

Content Determination of Astilbin in Tongfeng Granules by HPLC

DAI Nengjie，YANG Quanwei，CHENG Lu，HUANG Wentao

(Dept.of Pharmacy, Wuhan the First Hospital, Hubei Wuhan 430022, China)

OBJECTIVE：To establish the method for content determination of astilbin in Tongfeng granules. METHODS: Waters e2685 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) column was adopted with the mobile phase of 0.1% phosphoric acid(V∶V=40 ∶60), detection wavelength of 290 nm and flow rate of 1.0 ml/min. And the column temperature was 30 ℃ with sample quantity for 10 μl. RESULTS: The linear range of the astilbin in concentration was 0.099 8-0.998 0 μg(r=0.999 9). Relative standard deviation (RSD) of accuracy test, repeatability test and stability test were≤3.00%. The average recovery rate was 101.54%，RSD=0.54%(n=6). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate, and reproducible, which can be used for the quality control of gout granule.

Tongfeng granules; Astilbin; HPLC method

主管药师。研究方向：药物新制剂、新剂型研究。E-mail：25513218@qq.com

R927.2

A

1672-2124(2016)09-1232-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.09.031

2016-06-10)

*药师。研究方向：中药制剂研究。E-mail：112803190@qq.com