姜辉煌，侯爽，周祉延，李强，周长征△

1山东中医药大学，山东济南250355；2吉林大学口腔医学院

L16（45）正交实验优化鲜生姜黄酮类物质提取工艺

姜辉煌1，侯爽1，周祉延2，李强1，周长征1△

1山东中医药大学，山东济南250355；2吉林大学口腔医学院

目的：选用不同单因素水平，通过正交实验，研究从鲜生姜中提取黄酮物质的工艺条件。方法：选用芦丁作为标准对照，采用回流提取法，以紫外光度法测定其含量，选取切片厚度、乙醇浓度、提取温度、料液比等进行正交实验的方法学考察，得到最佳工艺流程。结果：鲜生姜原料切片厚2 m m，乙醇浓度85%，浸提温度80℃，固液比1:5 g/m L，在此条件下黄酮的收率最高。

鲜生姜；黄酮；提取工艺

生姜是姜科多年生草本植物姜的新鲜根茎，别名有姜根、百辣云、勾装指、因地辛。姜的根茎叶均可入药。生姜在传统中医药学里具有发散、止呕、止咳等功效［1］。近年研究表明生姜是治疗盐酸-乙醇性溃疡的有效药物，生姜醇提取物对麻醉猫血管运动中枢及呼吸中枢有兴奋作用［2］，生姜对中枢神经系统有抑制作用，提取的生姜挥发油能明显抑制小鼠自发活动及抗病原微生物、抗氧化作用［3］。目前生姜中黄酮类物质的提取方法主要有水提法，乙醇提取法、超声和微波提取法［4］，但上述提取方法基本以姜粉为提取原料。本研究从新鲜的生姜中提取黄酮类物质，省去干燥，粉碎的步骤，节约时间和能源。此方法较采用姜粉提取的黄酮总量高（按生姜平均含水量80%）。

1　材料与方法

1.1药物生姜购于济南长清区银座超市，经山东中医药大学高德民教授鉴定为此类植物的根茎。

1.2试剂乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸、镁粉、芦丁标准品、浓氨水、三氯化铝、芦丁对照品均购于中国药品生物制品检测所。

1.3仪器数显恒温水箱水浴锅；UV-6000型紫外分光光度计（上海元析仪器公司提供）；BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平股份有限公司提供）；旋蒸仪（上海亚荣仪器总厂提供）；中药切片机；高速离心机。

1.4方法

1.4.1提取条件的选择

1.4.1.1提取溶剂的选择取1 g生姜切片，选择切片厚度2 mm，于100 mL圆底烧瓶，加入水、乙醇、丙酮、甲醚各30 mL，于85℃提取3次，每次时长为1小时，合并滤液过滤，黄酮显色反应，测定黄酮含量，结果表明，溶剂为乙醇时黄酮的总得率最高，故提取溶剂选择乙醇，见表1。

表1　不同提取溶剂的黄酮提取效率

1.4.1.2提取方法的选择取1 g生姜切片，选择切片厚度2 mm，乙醇浓度为70%，分别用以下方法进行提取，黄酮显色反应，测定黄酮的含量，结果表明，回流提取时鲜生姜黄酮的得率最高，所以选择方法为回流提取，见表2。

表2　鲜生姜在不同提取方法时的黄酮提取率

1.4.2溶液的制备

1.4.2.1供试品溶液的制备精密称取1 g生姜切片，操作按正交实验设计相关因素进行，使用水浴加热每次提取1小时，冷却并超速离心（5 000 r/min），除去纤维不溶物，然后乙醇溶解，定容于20 mL容量瓶。

1.4.2.2黄酮类化合物含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合反应，将标准样品置于20 mL的容量瓶中，按贾冬英等［5］的方法处理，以试剂作为空白对照，在500 nm处进行紫外光吸收测定。回归方程：Y=0.0316X+0.0034（r2=0.9993），浓度范围0.005 6～0.034 7 mg/mL，见表3。

表3　芦丁标准曲线数据

1.4.3鲜生姜中总黄酮的含量测定精密量取“1.4.2.1”项下滤好的供试品1 mL于10 mL容量瓶，加0.3 mL 5%NaNO2于容量瓶中，摇匀静置6分钟；再加入0.3 mL10%AI（NO3）3于容量瓶内，摇匀静置5分钟；加入1 mo1/LNaOH 3 mL后摇匀静置12分钟定容至刻度，在500 nm处进行紫外吸收测定，平行测定2次，得出总黄酮总量。

1.4.4精密度实验取鲜生姜提取物各4份，依本实验含量测定方法显色并测定黄酮含量，黄酮总量平均量为10.37 mg/g，RSD为0.85%，表明精密度良好。

1.4.5回收率实验此药材已知含量的提取液中，加入一定含量的芦丁标准对照品，按照含量测定方法测定芦丁的平均含量96.82%，RSD为1.77%。

1.4.6正交实验设计依据相关文献，选定提取1小时为恒定指标，研究片厚A、提取温度B、体积分数C、料液比D、提取次数E等对总黄酮提取效果的影响，每个因素下设4个水平，进行正交实验设计，以总黄酮的得率作为评价指标，对该部位总黄酮的提取工艺进行优化，见表4。

表4　正交实验单因素水平

2　结果

2.1单因素实验设计结果与分析

2.1.1乙醇溶液体积分数对总黄酮含量的影响精密称取1.00 g生姜，以不同体积分数（65%，75%，85%、95%）的乙醇溶液为溶剂，料液比1∶20，提取温度为70℃，片厚为2 mm，提取次数为2次，每次1小时，结果显示，随着乙醇溶液体积分数的增大，提取率增大，在75%时达到最大，其后随着乙醇的体积分数增大提取率反而降低。造成该现象的原因可能是随着乙醇浓度的增大，水溶性黄酮减少而脂溶性物质溶出［6］。

2.1.2提取次数对总黄酮含量的影响精密称取1.00 g生姜，以体积分数为85%的乙醇溶液，料液比为1∶20，温度为70℃，片厚为2 mm，单次回流提取时间1小时，分别提取4次，结果显示，提取次数在1～3次时生姜总黄酮的得率增加，而3次后随着时间的增加，总黄酮的得率有所下降。可以得出不同提取时间对黄酮总得率影响较大。时间过短，黄酮不能充分溶出，时间过长可能造成黄酮类物质的分解损失［7］。

2.1.3固液比对总黄酮得率的影响精密称取1.00 g生姜，以体积分数为85%的乙醇溶液，温度为70℃，回流提取次数为2次，片厚2 mm，料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，结果可见，在固液比为1∶10时，提取可达到较好效果。若再增加提取溶剂的量对总黄酮得率增加效果影响不大，考虑到生产成本，固液比以1∶10为宜。

2.1.4提取温度对总黄酮得率的影响精密称取1.00g生姜，以体积分数为85%的乙醇溶液，回流提取次数为2次，料液比为1∶20，片厚为2 mm，温度为50℃、60℃、70℃、80℃，结果可见，随提取温度的升高，总黄酮的得率也逐渐升高，这是因为随着提取温度升高，分子的运动速度增加，渗透和扩散作用增强，使得黄酮类化合物更容易溶出，考虑到能耗，选择70℃为宜［8］。

2.1.5片厚对总黄酮得率的影响精密称取1.00 g生姜，以体积分数为85%的乙醇溶液，温度为70℃，回流提取次数为2次，料液比为1∶20，片厚为0.5 mm、1 mm、2 mm、4 mm，结果可见，片厚为1 mm时，黄酮得率较高，减少片厚对黄酮提取影响不大。

2.1.6正交实验按照表4利用正交设计对各因素的提取条件进行筛选，以黄酮含量为指标，平行测量两次，结果见表5。

表5L16（45）正交实验所得结果

通过正交实验数据可以发现，鲜生姜中总黄酮的提取最佳工艺为A3B1C3D4E2，影响提取的主要因素为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞片厚＞提取时间，乙醇浓度对其影响最大，片厚为2 mm，乙醇浓度85%，浸提温度80℃，固液比1∶5（g/mL）的条件下黄酮得率最高。

［1］黄泰康.常用中药成分及药理手册［M］.北京:中国医药科技出版社，1994：178.

［2］李素民，杨秀岭，赵智，等.干姜和生姜药理研究进展［J］.中草药，1999，30（6）:471-473.

［3］刘雪梅.生姜的药理作用研究进展［J］.中成药，2002，24（7）: 539-541.

［4］游见明.生姜黄酮的提取方法比较［J］.四川食品与发酵，2005，41（2）:29-31.

［5］贾冬英，乔玉兰，谭敏.用正交法探讨苦荞麦茎及籽壳中总黄酮芦丁的乙醇提取工艺［J］.食品科学，1997，18（6）:22-25.

［6］常楚瑞.乙酸乙酯回流法提取木瓜总黄酮及含量［J］.贵阳医学院学报，2001，26（4）:326-327.

［7］李瑞丽，乔五忠，王艳辉，等.葡萄籽原花青素的超声提取工艺研究［J］.食品研究与开发，2006，27（2）:64-66.

［8］李跃中，纵伟，董海丽.超声辅助提取菊花中绿原酸的工艺研究［J］.安徽农学通报，2008，14（9）:194-195.

The Extraction Process of F lavonoid Substances from Fresh Ginger Optimized by L16（45）Orthogonal Experiment

JIANG Huihuang1，HOU Shuang1，ZHOU Zhiyan2，LI Qiang1，ZHOU Changzheng1△
1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2 College of Oral Medicine of Jilin University

Objective:To study the extraction process of flavonoid substances from fresh ginger by choosing different single-factor levels in orthogonal experiment.Methods:The contents of flavonoid substances were detected by ultraviolet spectrophotometry after choosing rutin as standard control articles by reflux extraction method，the best extraction process was obtained by investigating the methodology of orthogonal experiment containing the thickness of the slice，the concentrations of ethanol，extraction temperature，solid-liquid ratio and others.Results: The thickness of fresh ginger slice is 2mm，the concentrations of ethanol was 85%，extraction temperature 80℃，solid-liquid ratio 1:5 g/mL，the yield of flavonoids reaches the highest under the conditions.

fresh ginger；flavonoids；the extraction process

R284.2

A

1004-6852（2016）05-0037-03

2015-03-20

姜辉煌（1990—），男，在读硕士研究生。研究方向：药剂学。

周长征（1966—），男，教授。研究方向：药物新剂型与新技术。