梁文娟，张荣光，段广才，王颖芳，洪丽娟，

张　冰1，王鹏飞1，郗园林1，杨海燕1

(1. 郑州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，河南郑州　450001；2. 新乡医学院分子诊断与医学检验技术河南省协同创新中心，河南新乡　453003；3. 河南科技大学预防医学教研室，河南洛阳　471023)



◇技术方法研究◇

基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测

梁文娟1,2，张荣光1，段广才1,2，王颖芳3，洪丽娟1，

张冰1，王鹏飞1，郗园林1，杨海燕1

(1. 郑州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，河南郑州450001；2. 新乡医学院分子诊断与医学检验技术河南省协同创新中心，河南新乡453003；3. 河南科技大学预防医学教研室，河南洛阳471023)

目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)，建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2，并将PCR产物测序；提取CRISPRdatabase数据库中(标准法)100株肠道细菌(47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPRFinder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPRdatabase数据库的CRISPR序列。ClustalX软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌，其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1，其间隔序列数目为3～26、2～9、2～32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2，其间隔序列数目为1～20、1～6、2～27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列(S1-1，S1-2，S1-3)和1条独特间隔序列(S2-1)。间隔序列比对结果显示，S1-1+S1-2+S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。……