李晓东，赵 颖，徐宜宏，吴渺渺，姜玲玲，刘 瑜，金 雁

（沈阳出入境检验检疫局，辽宁 沈阳 110016）

QuEChERS试剂盒—超高效液相色谱串联质谱法同时检测畜禽肉中18种喹诺酮类兽药残留研究

李晓东，赵 颖，徐宜宏，吴渺渺，姜玲玲，刘 瑜，金 雁

（沈阳出入境检验检疫局，辽宁 沈阳 110016）

建立了一种同时测定畜禽肉中18种喹诺酮类兽药残留的QuEChERS试剂盒—超高效液相色谱串联质谱检测方法。样品经1%乙酸乙腈水溶液（20∶80，V/V）振荡离心后，取上清液于净化管中净化，再取上清液浓缩至干，甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶4）溶解残渣，过膜，待测。采用C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱，UPLC-MS/MS法同时定性、定量测定畜禽肉中18种喹诺酮类兽药残留。结果表明，18种喹诺酮类兽药在0.5～80 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.99；以5.0、10.0、50.0 μg/kg 3个浓度水平进行添加回收实验，18种喹诺酮类兽药的平均回收率在60.5%～97.0%，相对标准偏差为2.1%～19.5%，该方法的检出限为5.0 μg/kg。该方法重现性好、灵敏度高、分析时间短、确证能力强，适用于畜禽肉中18种喹诺酮类兽药残留的同时检测。

畜禽肉；喹诺酮；QuEChERS试剂盒；液相色谱串联质谱

随着我国养殖业的飞速发展，以及全球生态环境不断恶化引起的各种动物疾病的频发，使得广大养殖户开始大量应用药物预防、治疗疾病，然而，动物在使用药物治疗后，药物的原型或其代谢产物可能蓄积、储存在动物的细胞、组织或器官中，形成“兽药残留”。消费者在食用了含有兽药残留的肉、蛋等动物源性食品后，其体内所残留的药物就会转移到人体中，长期食用该类食品，会导致慢性中毒、胃肠道疾病、加重肝脏负担等不良反应，对人体健康极为不利［1-3］。

喹诺酮类兽药作为一类广谱、高效的人工合成抗菌剂被广泛应用，因此，建立一种快速、安全、可靠的喹诺酮类兽药残留量检测方法已成为了发展趋势和研究热点，尤其对于样品的前处理，已经研究的方法有很多，如固相萃取法［4-7］、QuEChERS法［8-9］等。因此，笔者根据国内外残留限量要求，建立了畜禽肉中18种喹诺酮类兽药残留同时检测的QuEChERS试剂盒—高效液相色谱串联质谱法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 实验试剂：乙腈 （农残级，美国DiKMA公司）；甲醇（农残级，美国DiKMA公司）；甲酸（北京百灵威科技有限公司，纯度>98.0%）；乙酸（分析纯，国药试剂）；超纯水 （Milli-Q Water System纯化制备）；QuEChERS试剂盒。

1.1.2 实验仪器：ACQUITYTM超高效液相色谱仪（美国Waters公司），AB Sciex QTrap 6500四极杆—离子阱质谱仪（美国AB公司），Millipore-Elix-QEQG超纯水机 （美国Millipore公司），CPA 225D，分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 样品预处理

1.2.1 样品提取：称取鸡肉糜样品5.00 g（精确到0.01 g）放入50 mL萃取管中，加入20 mL 1%的乙酸乙腈水溶液（80%乙腈，20%水），涡旋振荡3 min，5 000 r/min离心5 min。

1.2.2 样品净化：准确移取5 mL上清液于净化管中，涡旋混匀1 min，5 000 r/min离心3 min，取上清液，40 ℃浓缩至干，1 mL 甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶4）溶解残渣，过0.2 μm滤膜，待测。

1.3 色谱与质谱条件的选择

1.3.1 液相色谱条件的选择：色谱柱为Waters BEH C18，100 mm×2.1 mm（内径），1.7 μm；柱温为 40 ℃；进样量为10 μL；流动相A为0.2%甲酸水溶液；流动相B为0.2%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件的选择：离子源为电喷雾离子源，扫描模式为正离子扫描，检测方式为多反应监测（MRM），电喷雾电压（IS）为 5 500 V，雾化气压力（GS1）为 50 psi，气帘气压力（CUR）为 30 psi，辅助气压力（GS2）为 60 psi，离子源温度（TEM）为550 ℃，去簇电压（DP）为 80 V，入口电压（EP）为10 V。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择 称取2 g均质后的鸡肉糜，加入18种喹诺酮类兽药混合标准溶液，制成模拟加标样品，分别加入8 mL乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷，均质提取1 min，离心，测定回收率，同时做空白对照，18种兽药在不同提取溶剂下，回收率的大小差异显著（见表2）。

表2 18种兽药在不同提取溶剂下的回收率 %

乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷是实验室常用极性化合物的提取溶剂，所考察的18种喹诺酮类兽药均在以乙腈为提取溶剂时有较高的回收率，且乙腈有去蛋白的作用，故而提取液的澄清度也较好，有利于后续净化步骤。且喹诺酮类兽药在中性偏酸的环境中具有良好的稳定性，因此在提取溶液中加入冰醋酸，有助于提高兽药的稳定性，进而提高兽药的提取效率。

2.2 质谱条件的优化 经过反复试验、调试，得出18种喹诺酮类兽药的最优质谱条件。各兽药的检测离子见表3。

3 方法学验证

3.1 回收率及精密度 在猪肉、牛肉、鸡肉中添加不同含量水平（5.0、10.0、50.0 μg/kg）的 18 种喹诺酮类兽药混标，制成模拟加标样品，按上述实验方法操作，同时做空白对照。所得到的样品中各待测兽药的添加回收率和相对标准偏差见表4、表 5、表 6。

实验结果表明，在所考察的猪肉、牛肉、鸡肉中，18种喹诺酮类兽药的回收率在60.5%～97.0%，相对标准偏差为2.1%～19.5%，待测兽药均能得到较理想的回收率，该方法符合检测方法对精密度的要求。

表3 待测兽药的质谱参数

3.2 线性关系和检出限 用空白样品溶液稀释混合标准储备溶液，制备成不同浓度的混合标准工作溶液，在选定色谱和质谱条件下，用混合标准工作溶液分别进样，以峰面积（y）为纵坐标，以工作溶液的浓度为横坐标，在5.0～80 ng/mL范围内绘制6点标准工作曲线。标准工作曲线、线性回归方程及相关系数（r）见表7。向空白样品中添加不同质量的标准溶液，按上述方法进行测定，得出18种喹诺酮类兽药的检出限均为5.0 g/kg。

4 结论

该实验建立了畜禽肉中18种喹诺酮类兽药残留的样品前处理和仪器定性定量方法。以1%乙酸乙腈水溶液提取，提取液经QuEChERS试剂盒法净化UPLC-MS/MS确证检测。该方法准确性和重复性好、灵敏度高，完全满足畜禽肉中18种喹诺酮类兽药检测需要，具有一定的创新性和可推广应用的价值。

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［3］张彩云，刘小静，宋瑞，等.动物性食品兽药残留的危害及其控制［J］.今日畜牧兽医，2011（S1）：83-86.

［4］杨方，庞国芳，刘正才，等.液相色谱—串联质谱法检测水产品中15种喹诺酮类药物残留量［J］.分析试验室，2008，27（12）：27-33.

表4 猪肉中18种兽药不同添加水平下的回收率和相对标准偏差（n=6）

表5 牛肉中18种兽药不同添加水平下的回收率和相对标准偏差（n=6）

［5］杨卫军，李曼，曹秀梅，等.超高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留［J］.现代畜牧兽医，2016（4）：6-10.

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表6 鸡肉中18种兽药不同添加水平下的回收率和相对标准偏差（n=6）

表7 18种兽药的线性回归方程、相关系数（r）、检出限

［9］曹慧，陈小珍，朱岩，等.QuEChERS-超高效液相色谱—串联质谱技术同时测定乳制品中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留［J］.食品科技，2013，38（6）：323-329.

Simultaneous Determination of 18 Quinolone Residues in Livestock and Poultry Meat by QuEChERS Kit-UPLC/MS/MS

LI Xiao-dong，ZHAO Ying，XU Yi-hong，WU Miao-miao，JIANG Ling-ling，LIU Yu，JIN Yan
（Shenyang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenyang 110016，China）

A QuEChERS Kit-UPLC/MS/MS method for simultaneously determination of 18 quinolone residues in livestock and poultry meat was developed in this study.The samples were oscillated and centrifuged in a 1%aqueous solution of acetic acid and acetonitrile （20∶80,V/V）.The obtained supernatant was purified after transferring to purification pipe and was then concentrated to dry.The residues were dissolved in aqueous solution of methanol （methanol∶water=1 ∶4） and were then filtered.The C18chromatographic column （100 mm×2.1 mm,1.7 μm） was used to isolate,and the 0.2%aqueous solution of formic acid and acetonitrile solution containing 0.2%formic acid were used as mobile phase to gradient elute.The 18 quinolone residues in livestock and poultry meat were qualitatively and quantitatively determined by UPLC/MS/MS.A good linear relationship of the 18 quinolone in the range of 0.5-80 ng/mL was observed,and the correlation coefficient （r） was all above 0.99.Recovery test was performed with three concentration levels of 5.0,10.0,50.0 μg/kg.The average recovery of the 18 quinolone ranged from 60.5%to 97.0%,the relative standard deviation ranged from 2.1%to 19.5%,and the detection limit of the method was 5.0 μg/kg.The developed method with good reproducibility,high sensitivity,short analysis time and strong ability of confirmation was suitable for the simultaneous determination of 18 quinolone residues in livestock and poultry meat.

livestock and poultry meat；quinolone；QuEChERS kit；UPLC/MS/MS

S859.84

A文章顺序编号：1672-5190（2016）12-0012-05

2016-11-22

项目来源：沈阳市科技局项目（F15-168-4-00）。

李晓东（1986—），男，工程师，主要从事农兽药残留检测工作。

（责任编辑：慕宗杰）