陈燊，黄雯，张梅，张国娟

(首都医科大学附属北京同仁医院，北京100060)



·基础研究·

内源性硫化氢对糖尿病大鼠肾成纤维细胞增殖的影响

陈燊，黄雯，张梅，张国娟

(首都医科大学附属北京同仁医院，北京100060)

目的探讨内源性硫化氢(H2S)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾成纤维细胞增殖的影响。方法 取雄性SD大鼠21只，随机分为对照组、DN组、治疗组各7只。除对照组外，其余两组均予一次性腹腔注射0.1%链脲佐菌素60 mg/kg制备糖尿病模型。治疗组给予每日腹腔注射NaHS治疗，其余两组给予每日腹腔注射同等剂量生理盐水，均干预8周。干预第8周末处死大鼠，计算各组相对肾重，HE染色法观察各组肾组织病理改变，六胺银染色(PASM)法观察肾小球系膜增生及肾小球硬化等病理改变。BrdU掺入法观察肾成纤维细胞增殖情况，免疫组化法观察肾组织系膜纤维连接蛋白(FN)表达。结果 DN组相对肾重高于对照组及治疗组(P均<0.01)。光镜及PASM染色示，DN组出现肾小球毛细血管球肥大、基底膜轻度增厚、系膜增生、基质增多等改变，治疗组病理改变显著轻于DN组，对照组未见上述病理变化。DN组BrdU阳性细胞/阴性细胞百分比、肾组织FN表达量均高于对照组及治疗组(P均<0.01)。结论 内源性H2S可抑制DN大鼠肾成纤维细胞增殖、减少FN表达，可能是内源性H2S减缓DN进展的机制之一。

硫化氢；糖尿病肾病；成纤维细胞；纤维连接蛋白

糖尿病患者中约30%以上会出现糖尿病肾病(DN)，是导致终末期肾病的重要原因。DN可导致肾成纤维细胞增生分化，进而引起纤维连接蛋白(FN)等细胞外基质的积聚和肾小球硬化。内源性硫化氢(H2S)是一种气体信号分子，人体内主要通过胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶 (CSE)合成。研究发现，内源性H2S的缺乏与高血压、脑缺血等多种病理状态进展及组织损伤有关[1,2]，在慢性肾脏病的进展中也发挥重要作用。NaHS在水溶液中发生化学反应后，1/3将转化为H2S气体，因而NaHS治疗可以提高体内H2S含量，纠正内源性H2S的不足。2014年5月～2015年4月，我们采用NaHS干预DN模型大鼠，观察内源性H2S对肾成纤维细胞增殖的影响，探讨内源性H2S改善DN大鼠肾小球硬化的作用。

1　材料与方法

1.1动物及材料清洁型雄性SD大鼠21只，体质量140～180 g。链脲佐菌素(STZ，北京化学试剂公司)；NaHS(北京化学试剂公司)；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU，美国Sigma公司)；BrdU抗体(美国Vector公司)；BrdU二抗羊抗兔单克隆抗体、FN一抗兔抗鼠单克隆抗体、生物素抗兔单克隆二抗(美国博士德公司)。

1.2动物分组及模型制备将大鼠随机分为对照组、DN组、治疗组各7只。除对照组外，其余两组均予一次性腹腔注射0.1% STZ 60 mg/kg制备糖尿病模型。72 h后采集尾静脉血检测血糖，以血糖>16.65 mmol/L为造模成功，所有模型均造模成功。

1.3干预方法治疗组每日腹腔注射56 μmol/kg的NaHS，DN组及对照组每日腹腔注射生理盐水0.25 mL，均干预8周。

1.4肾重测定每周一晨9点称体质量，干预第8周末处死大鼠，处死前称体质量并记录，取出肾脏称重，计算相对肾重(双肾重量与处死前体质量比)。

1.5细胞标记采用BrdU掺入法。干预第8周末处死大鼠前2 h，腹腔注射BrdU 50 mg/kg。BrdU作为胸腺嘧啶核苷的类似物，作为DNA合成的原料掺入到细胞中，新合成的双链DNA通过免疫组化法染色呈阳性，标记为阳性细胞。通过肾小球BrdU阳性细胞/阴性细胞百分比及肾小球FN表达表示肾成纤维细胞增殖情况。

1.6肾成纤维细胞增殖情况观察采用BrdU染色法。将肾组织以5 μm连续切片，脱蜡至水，加入0.3%过氧化氢甲醇，室温孵育30 min，加入2 mol/L HCl 37 ℃，破坏细胞核，使细胞核内DNA变性，室温孵育3 min；加入1 mol/L NaOH室温孵育2 min。加入0.05%胰蛋白酶，室温孵育，加入10%羊血清，室温孵育。加入BrdU一抗，4 ℃过夜；加入BrdU二抗室温孵育，加入SABC(1∶100)室温孵育。DAB镜下显色，封片。采用AST计算机及Mias-300软件，每个标本选取15个肾小球进行光镜观察，以细胞核呈棕褐色者为阳性细胞，计算阳性细胞与阴性细胞的百分比。

1.7肾组织病理检查将肾组织制作石蜡切片，行HE染色，于400倍光镜下观察各组肾组织病理改变。六胺银染色(PASM)观察肾小球系膜增生及肾小球硬化等病理改变。

1.8肾组织系膜FN检测采用免疫组化法。肾组织切片抗原修复，一抗为兔抗鼠单克隆抗体、二抗为生物素抗兔单克隆抗体。DAB显色，苏木素复染。采用AST计算机及Mias-300软件，每个标本选取15个肾小球进行观察，测量每个肾小球中着色的系膜基质面积和整个肾小球面积，以二者的百分比表示FN在肾小球系膜基质中的含量。

2　结果

2.1各组相对肾重比较DN组相对肾重高于对照组及治疗组(P均<0.01)。详见表1。

2.2各种肾组织病理改变光镜及PASM染色示，DN组肾小球的毛细血管球肥大，基底膜轻度增厚，系膜增生，基质增多，系膜区明显增宽。治疗组肾脏仅见系膜轻度增生，肾小球毛细血管球轻度肥大，病理改变显著轻于DN组。对照组未见上述病理变化。

2.3各组肾成纤维细胞增殖情况比较DN组BrdU阳性细胞与阴性细胞的百分比高于对照组及治疗组(P均<0.01)。详见表1。

2.4各组肾组织系膜FN含量比较DN组肾组织FN含量高于对照组及治疗组(P均<0.01)。详见表1。

表1　三组相对肾重、BrdU阳性细胞/阴性细胞百分比及系膜FN含量比较

注：与对照组比较，#P<0.01；与DN组比较，*P<0.01。

3　讨论

DN发病机制与糖代谢紊乱(如多元醇通络的活化、蛋白激酶C 的激活、糖基化终末产物的积聚等)、血流动力学异常及遗传因素等有关[3]。虽然近年来许多学者对DN 的发病机制做了大量的研究，但其机制尚未完全阐明。DN的主要病理改变是肾脏的高灌注、高滤过，导致肾小球基底膜增厚，出现以肾小球系膜区为主的细胞外基质增厚和积累，并最终导致肾小球硬化，其中肌性成纤维细胞的增殖发挥了重要作用。

肌性成纤维细胞具有较强的增殖和分泌能力，几乎不存在于正常肾脏中，病理情况下肾成纤维细胞可增殖转化为肌性成纤维细胞，分泌大量胶原，参与肾小球细胞外基质的过度积聚，导致肾小球硬化。肌性成纤维细胞产生的细胞外基质包括胶原Ⅰ、Ⅲ、FN等，其中FN的变化出现早且明显，它的异常增高提示细胞外基质过度积聚，是DN发生后肾小球硬化和肾间质纤维化的主要表现之一[4]。本研究发现，与对照组比较，DN组大鼠的相对肾重明显增加，提示出现肾脏肥大；DN组大鼠肾脏BrdU标记阳性细胞增生明显，主要集中于肾小球系膜区，表明肾成纤维细胞内DNA复制活跃；DN组肾组织中FN含量高于对照组，提示正常大鼠肾组织系膜FN含量较少，而DN大鼠肾组织系膜FN表达较高，推测BrdU标记的增殖活跃细胞为肾成纤维细胞，其大量增殖可能与肾小球硬化病理改变有关。

内源性H2S是具有舒张血管、抑制平滑肌细胞增殖等特性的气体信号分子，能够减轻心脏、肝脏和肺脏纤维化[5～7]。近年研究发现，H2S在肾脏病变的进展中发挥重要作用，在缺氧状态下能够增加肾髓质的血流量[8]。H2S对切除5/6肾脏后的CKD模型也具有保护作用[9]。H2S能够降低富含肾素的As4.1细胞内环磷酸腺苷(cAMP)表达，抑制肾素释放[10,11]。Kai等研究显示，内源性H2S的缺乏是导致肾间质纤维化的主要原因[12]。在糖尿病的发病过程中，由于肾脏CSE mRNA的表达降低，可导致内源性H2S的缺乏，NaHS治疗可通过促进内源性H2S生成，从而减轻DN大鼠肾脏病理损伤程度[13]，推测内源性H2S缺乏可能与DN肾脏病变进展有关，其机制可能为：血糖升高可使内源性H2S缺乏，导致p53蛋白、p21和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达增加，对肾脏成纤维细胞内的DNA合成和增殖相关蛋白调控作用减弱，促进转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾脏成纤维细胞转化为肌性成纤维细胞，使细胞外基质的合成明显增加，导致肾小球的硬化[12,14,15]。本研究发现，治疗组病理改变较DN组明显减轻，BrdU阳性细胞数明显减少，肾组织FN表达降低，提示外源性H2S治疗可以减少肾小球成纤维细胞增殖和细胞外基质的生成，可能与外源性H2S对相关蛋白调控作用增强，降低了肾成纤维细胞内DNA的复制，使FN表达降低，延缓肾小球的硬化过程有关。

[1] Bian JS, Yong QC, PanTT, et al. Role of hydrogen sul phide in the cardio protection caused by ischemic preconditioning in the rat heart and cardiac myocytes [J]. J Phar macol Exp Ther, 2006,316(2):670-678.

[2] Fiorucci S, AntonelliE, Distrutti E, et al. Inhibition of hydrogen sulfide generation contributes to gastric injury caused by anti-inflammatory nonsteroidal drugs[J]. Gastroenterology, 2005,129(4):1210-1224.

[3] 李敏州,高彦彬,马鸣飞,等.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,22(18):344-349.

[4] Sato M, Muragaki Y, Saika S, et al. Targeted smad3 signaling protects against renal disruption of TGF-beta1/tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction[J]. J Clin Invest, 2003,112(10): 1486-1494.

[5] Fang L, Li H, Tang C. Hydrogen sulfide attenuates the pathogenesis of pulmonary fibrosis induced by bleomycin in rats[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2009,87(7):531-538.

[6] El-Seweidy MM, Sadik NA, Shaker OG. Role of sulfurous mineral water and sodium hydrosulfide as potent inhibitors of fibrosis in the heart of diabetic rats[J]. Arch Biochem Biophys, 2011,506(1):48-57.

[7] Tan G, Pan S, Li J, et al. Hydrogen sulfide attenuates carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity, liver cirrhosis and portal hypertension in rats[J]. PLoS One, 2011,6(10): e2594.

[8] Beltowski J. Hypoxia in the renal medulla: implications for hydrogen sulfide signaling[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2010,334(2):358-363.

[9] Aminzadeh MA, Vaziri ND. Downregulation of the renal and hepatic hydrogen sulfide (H2S)-producing enzymes and capacity in chronic kidney disease[J]. Nephrol Dial Transplant, 2012,27(2):498-504.

[10] Lu M, Liu YH, Ho CY, et al. Hydrogen sulfide regulates cAMP homeostasis and renin degranulation in As4.1 and rat renin-rich kidney cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2012,302(1):59-66.

[11] Lu M, Liu Y, Goh HS, et al. Hydrogen sulfide inhibits plasma rennin activity[J]. J Am Soc Nephrol, 2010,21(6):993-1002.

[12] Kai S, Fen W, Yong BS. Hydrogen sulfide inhibits renal fibrosis of obstructive nephropathy[J]. Kidney Int, 2014,85(6):1318-1329.

[13] 陈燊,黄雯,张红,等.内源性硫化氢在糖尿病肾病大鼠肾组织中表达[J].中国血液净化,2010,9(8):433-435.

[14] Fang LP, Lin Q, Tang CS, et al. Hydrogen sulfide suppresses migration, proliferation and myofibroblast transdifferentiation of human lung fibroblasts[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2009,22(6):554-561.

[15] Schwer CI, Stoll P, Goebel U, et al. Effects of hydrogen sulfide on rat pancreatic stellate cells[J]. Pancreas, 2012,41(1):74-83.

Effect of endogenous H2S on proliferation of kidney fibroblasts in rats with diabetic nephropathy

CHENShen,HUANGWen,ZHANGMei,ZHANGGuojuan

(BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100060,China)

ObjectiveTo investigate the effect of endogenous hydrogen sulfide (H2S) on the proliferation of kidney fibroblasts in rats with diabetic nephropathy (DN).MethodsTwenty-one male rats (Sprague-Dawley) were randomly divided into three groups (for each groupn=7): the control group, DN group and DN+H2S group. Diabetes was induced in the rats of these groups by 0.1% streptozotocin (STZ) except the control group. Rats of the DN+H2S group were injected with NaHS every day intraperitoneally, other groups were injected with 0.9% physiological saline. Eight weeks later, rats were killed, the relative kidney weigh (KW/BW) was calculated, the pathological changes in renal tissues was observed by HE staining, and the mesangial proliferation and glomerulosclerosis was observed by PASM. The kidney proliferation was observed by BrdU incorporation assay and the expression of fibronectin (FN) in glomerulars was detected by immunohistochemistry. ResultsDN rats exhibited higher KW/BW than the control and DN+H2S groups (allP<0.01). DN rats represented glomerular capillary bolus hypertrophy, mild thickening of basal membrane, mesangial proliferation and mesanglial matrix increase under light microscope and PASM. The pathological changes of the DN+H2S group were much milder than those of the DN group. The control rats showed no pathological change as expected. The proportion of BrdU positive cells and the expression of FN in the DN group were significantly higher than those of the DN+H2S and control groups (allP<0.01). ConclusionThe endogenous H2S is able to inhibit the fibroblast proliferation and decrease the expression of FN in glomerulars, which may be one of the mechanisms for endogenous H2S to delay the progression of DN.

hydrogen sulfide; diabetic nephropathy; fibroblast; fibronectin

首都医科大学北京同仁医院基金项目(2014-FZD-026)。

黄雯(E-mail: huangw@trhos.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.008

R587.2

A

1002-266X(2016)30-0028-03

2015-12-02)

关键词：硫化氢；糖尿病肾病；成纤维细胞；纤维连接蛋白