潘罅，尹友生，李清初，李康慧，韦家智，马文峰，冷斌

(桂林医学院附属医院，广西桂林541000)



雷洛昔芬对镉染毒后肾小管上皮细胞存活情况及1-α羟化酶表达的影响

潘罅，尹友生，李清初，李康慧，韦家智，马文峰，冷斌

(桂林医学院附属医院，广西桂林541000)

目的观察应用雷洛昔芬对镉染毒的肾小管上皮细胞存活情况及1-α羟化酶表达的影响，探讨雷洛昔芬治疗镉中毒导致肾毒性的机制。方法 分离纯化SD大鼠肾小管上皮细胞原代细胞。分别用浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的氯化镉对肾小管上皮细胞染毒24 h，采用MTT法测算肾小管上皮细胞的相对存活率。选取20.0 μmol/L的氯化镉剂量作用于肾小管上皮细胞，分别用0.05、0.10、0.50、1.00 μmol/L的雷洛昔芬干预24 h，采用MTT法测算肾小管上皮细胞的相对存活率。将肾小管上皮细胞分为空白对照组、氯化镉组、雷洛昔芬组，空白对照组培养于DMEM 培养基，氯化镉组以20.0 μmol/L的氯化镉染毒肾小管上皮细胞，雷洛昔芬组以20.0 μmol/L的氯化镉染毒后给予雷洛昔芬0.10 μmol/L干预，均干预24 h，在显微镜下观察细胞形态，采用RT-PCR法检测肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA表达。结果 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的氯化镉干预24 h后，肾小管上皮细胞的相对存活率均降低(P均<0.01)，且氯化镉浓度较高时细胞相对存活率较低。对镉染毒后的肾小管上皮细胞以0.05、0.10、0.50、1.00 μmol/L的雷洛昔芬干预24 h后，肾小管上皮细胞的相对存活率均高于镉染毒细胞(P均<0.01)。空白对照组肾小管上皮细胞形态正常，氯化镉组肾小管上皮细胞形态异常、大量细胞死亡，雷洛昔芬组细胞形态异常较氯化镉组明显减轻。氯化镉组肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA相对表达量低于空白对照组，雷洛昔芬组1-α羟化酶mRNA相对表达量高于氯化镉组(P均<0.05)。结论 雷洛昔芬对氯化镉染毒的肾小管上皮细胞具有保护作用，可上调镉染毒后肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA的表达。

肾小管上皮细胞；雷洛昔芬；氯化镉；镉中毒；肾毒性;1-α羟化酶；骨质疏松

随着经济发展，环境污染已成为严重影响人群健康的重要因素，其中重金属污染导致的疾病备受关注。上世纪日本“痛痛病”就是因长期饮用被硫酸镉污染的水引起的慢性镉中毒。肾脏与骨骼是镉中毒常见的靶器官[1]，慢性镉中毒最主要的临床表现是导致钙流失，从而引起骨质疏松。目前研究认为，镉中度导致的骨质疏松继发于肾损伤[2]。雷洛昔芬是一种雌激素受体调节剂，临床常用于骨质疏松的治疗。1-α羟化酶是调节体内钙磷代谢的活性维生素D合成的关键酶。2014年5月～2015年11月，我们以SD大鼠原代肾小管上皮细胞为研究对象，观察雷洛昔芬对氯化镉染毒后肾小管上皮细胞存活情况及1-α羟化酶表达的影响，探讨雷洛昔芬对镉中毒后肾毒性的影响。

1　材料与方法

1.1动物与试剂新生(出生不足24 h)SD大鼠10只，购于桂林医学院动物实验中心。氯化镉(国药集团化学试剂有限公司)；盐酸雷洛昔芬(大连美仑生物技术有限公司);DMEM 低糖培养液(美国Gibco 公司)；胎牛血清(美国Gemini公司)；TRIzol 试剂、逆转录酶试剂盒、2×Taq PCR Master Mix 及 DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)；引物(美国Invitrogen 公司)；四氮唑蓝(MTT，美国Amresco 公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；青-链霉素混合液(美国Hyclone 公司)；Percoll细胞分离液(GE公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)。

1.2原代肾小管上皮细胞的提取及培养取新生SD大鼠双肾，去除包膜及肾蒂，分离剪碎肾皮质，剪碎至约1 mm大小，转移至浓度为1 g/LⅠ型胶原酶的DMEM溶液中。将得到的细胞悬液转移至100目不锈钢网上，过滤、研磨，网下液体经200目筛网过滤后，离心后弃上清，将细胞沉淀用含血清的DMEM制成5 mL细胞悬液。取预先配好的45% Percoll分离液，将细胞悬液轻铺其上，离心后取近管底第2层细胞悬液，即为近端肾小管节段及其游离的肾小管上皮细胞。原代培养5～7 d后，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，离心后按1∶2分装接种。第4天可传第2代。经细胞形态学鉴定，细胞形态符合肾小管上皮细胞特点。

1.3氯化镉对肾小管上皮细胞存活的影响观察

1.3.1镉染毒将对数增长期的肾小管上皮细胞以1×105/mL接种于96孔板，每组设5个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养24 h。加入20 μL MTT培养4 h后，分别用浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的氯化镉对肾小管上皮细胞染毒24 h。空白对照组用不含氯化镉的DMEM处理24 h。

1.3.2肾小管上皮细胞相对存活率测算采用MTT法。以上各浓度的氯化镉染毒后，吸弃孔内培养液，加入DMSO 150 μL，避光振荡10 min，待结晶充分溶解后，以490 nm波长测OD值，计算细胞相对存活率=(OD氯化镉各浓度/OD空白对照组)×100%。实验重复3次。

1.4雷洛昔芬对镉染毒后肾小管上皮细胞存活的影响观察根据1.3.2得到的镉染毒后细胞相对存活率结果，选用细胞相对存活率接近50%的氯化镉浓度20.0 μmol/L对肾小管上皮细胞染毒，然后分别用0.05、0.10、0.50、1.00 μmol/L的雷洛昔芬干预24 h。采用MTT法测定肾小管上皮细胞的相对存活率。设立镉染毒对照组，将肾小管上皮细胞以20.0 μmol/L氯化镉染毒后用DMEM干预24 h。相对存活率=(OD雷洛昔芬各浓度/OD镉染毒对照组)×100%。

1.5雷洛昔芬对镉染毒后肾小管上皮细胞形态及1-α羟化酶mRNA表达的影响观察

1.5.1细胞分组及干预将对数生长期的肾小管上皮细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁24 h后，分为空白对照组、氯化镉组、雷洛昔芬组。空白对照组仅培养于DMEM 培养基；氯化镉组以20.0 μmol/L的氯化镉染毒肾小管上皮细胞；雷洛昔芬组以20.0 μmol/L的氯化镉染毒后，给予雷洛昔芬0.1 μmol/L干预。均干预24 h。

1.5.2肾小管上皮细胞形态学观察在显微镜下观察细胞形态。

1.5.3肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA表达检测采用RT-PCR法。培养24 h后收集各组细胞。细胞总RNA的提取按TRIzol总RNA提取试剂说明书操作。以 cDNA 为模板进行RT-PCR反应，反应体系为20.0 μL。引物由Invitrogen公司合成，序列如下：1-α羟化酶上游5′-ACACACACACACCAATATGT-3′，下游5′-TGGTGCCAGTAAAGTCAGGAA-3′，159 bp；GAPDH 上游5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′，221 bp。PCR 反应条件：预变性94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、61 ℃1 min、72 ℃ 30 s共30个循环，72 ℃ 5 min。取 PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳，所得电泳灰度图片用Sensi Ansys 凝胶图像分析软件分析，测量各条带灰度值(IOD)，以1-α羟化酶mRNA IOD 值与GAPDH的比值表示1-α羟化酶mRNA的相对表达量。

2　结果

2.1不同浓度氯化镉对肾小管上皮细胞存活的影响结果2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L氯化镉干预24 h后，肾小管上皮细胞的相对存活率分别为80.136 5%、61.448 1%、57.050 8%、51.819 6%、33.586 1%，均低于空白对照组(P均<0.01)。

2.2不同浓度雷洛昔芬对镉染毒肾小管上皮细胞存活的影响结果0.05、0.10、0.50、1.00 μmol/L的雷洛昔芬干预24 h后，肾小管上皮细胞的相对存活率分别为157.110 6%、168.848 8%、140.632 1%、137.923 3%，各浓度雷洛昔芬干预24 h后肾小管上皮细胞的相对存活率均高于镉染毒对照组(P均<0.01)。

2.3各组肾小管上皮细胞形态学表现空白对照组肾小管上皮细胞形态正常；氯化镉组肾小管上皮细胞与培养皿底贴合不紧密，大部分细胞形态异常，大量细胞死亡；雷洛昔芬组病理改变较氯化镉组明显减轻，肾小管上皮细胞与培养皿底贴合较紧密，较少数细胞发生形态改变。

2.4各组肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA表达比较 氯化镉组肾小管上皮细胞中的1-α羟化酶mRNA相对表达量低于空白对照组，雷洛昔芬组1-α羟化酶mRNA相对表达量高于氯化镉组(P均<0.05)。见图1、2。

注：A为空白对照组；B为氯化镉组；C为雷洛昔芬组。Marker左侧为1-α羟化酶mRNA，右侧为GAPDH。

图1各组肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA表达情况(RT-PCR法)

图2　各组肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA相对表达量

3　讨论

镉是已知的在生物体内最易蓄积的毒物之一，很少量的镉进入体内就可因生物蓄积和生物放大作用，对机体产生一系列的损伤[3]。镉可导致机体急、慢性中毒，急性镉中毒可引起机体多种靶器官及组织损伤，慢性镉中毒可导致肾脏、肝脏、骨骼、神经、血液和睾丸等多器官损伤。肾脏是镉蓄积的最主要靶器官[4]。本研究发现，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的氯化镉干预24 h后，肾小管上皮细胞存活率均低于空白对照组，且氯化镉浓度较高时细胞存活率较低，提示氯化镉对肾小管上皮细胞具有毒性损伤作用，低浓度的氯化镉就能使肾小管上皮细胞的细胞活力下降。

镉肾毒性的最初表现通常是肾小管功能障碍[5]。1-α羟化酶主要存在于肾小管上皮细胞线粒体内，是活性维生素D31-α羟基化的关键酶[6]。维生素D经过肝细胞线粒体及近端肾小管上皮细胞线粒体两次羟化，形成具有生物活性的1，25-(OH)2D3，活性维生素D作用于维生素D受体(VDR)，对钙磷平衡、骨代谢、细胞分化和增殖起着重要的调节作用[7]。生理剂量的活性维生素D3能促进肠道及肾脏对钙离子的吸收，增加骨钙含量，其缺乏可以导致骨质疏松。而雌激素能提高1-α羟化酶的活性[8]，进而影响活性维生素D3，调节体内钙磷代谢。本研究发现，氯化镉组肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA相对表达量低于空白对照组，提示氯化镉可造成肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA表达降低。

雷洛昔芬是新型的选择性雌激素受体调节剂[9]，对骨组织具有雌激素样保护作用，在乳腺和子宫组织中则具有拮抗雌激素作用，常被用于骨质疏松的治疗，不良反应较小[10]。研究表明，雌激素和雷洛昔芬均能有效治疗绝经后妇女的骨质疏松症[11]。但雷洛昔芬具有不增加乳腺癌发生率等优点。研究发现，雷洛昔芬治疗绝经后妇女骨质疏松的同时，还可以延缓肾功能衰竭并且降低患者病死率，这可能与调节雌激素受体参与肾脏保护功能有关[12]。本研究发现，0.05、0.10、0.50、1.00 μmol/L的雷洛昔芬干预镉染毒细胞24 h后，肾小管上皮细胞的存活率均高于镉染毒对照组，表明各浓度的雷洛昔芬均可提高镉染毒肾小管上皮细胞的存活率、促进肾小管上皮细胞的生长，雷洛昔芬对于镉染毒的肾小管上皮细胞具有保护作用；细胞形态学观察发现，空白对照组肾小管上皮细胞形态正常，氯化镉组肾小管上皮细胞形态异常，大量细胞死亡，而雷洛昔芬组肾小管上皮细胞病理改变较氯化镉组明显减轻，提示镉染毒对肾小管上皮细胞具有毒性损伤作用，而雷洛昔芬对镉染毒后肾小管上皮细胞的毒性损伤具有明显的保护作用。本研究发现，雷洛昔芬组1-α羟化酶mRNA相对表达量高于氯化镉组，提示雷洛昔芬可上调镉染毒后肾小管上皮细胞1-α羟化酶mRNA表达，可能是其进一步发挥对镉染毒后骨质疏松治疗作用的机制之一。

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Effect of raloxifene on cell survival and expression of 1-α-hydroxylase in cadmium-induced renal tubular epithelial cells

PANXia,YINYousheng,LIQingchu,LIKanghui,WEIJiazhi,MAWenfeng,LENGBin

(1AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

ObjectiveTo observe the effect of raloxifene on the cell survival and the expression of 1-α-hydroxylase in renal tubular epithelial cells induced by cadmium chloride, and to invesitage the mechanism of osteoporosis caused by cadmium poisoning. MethodsThe primary renal tubular epithelial cells of SD rats were centrifugated and purified. Using different concentrations (2.5, 5.0, 10.0, 20.0 and 40.0 μmol/L) of cadmium chloride to interfere renal tubular epithelial cells and evaluating the relative survival rate of renal tubular epithelial cells by MTT after 24 h. Using cadmium chloride (20 μmol/L) and different concentrations (0.05, 0.10, 0.50 and 1.00 μmol/L) of raloxifene to interfere the renal tubular epithelial cells and evaluating the survival rate of renal tubular epithelial cells by MTT after 24 h. The renal tubular epithelial cells were divided into the blank control group, cadmium chloride group and raloxifene group. In the blank control group, we used 10 mL DMEM to cultured cells. In the cadmium chloride group, we used 10 mL cadmium chloride (20 μmol/L) to interfere cells. In the raloxifene group, we used 10 mL cadmium chloride (20 μmol/L) and raloxifene (0.1 μmol/L) to interfere cells. The cell morphology was observed and photographed under a microscope after 24 hours. The expression of 1-α-hydroxylase mRNA was detected by using RT-PCR.ResultsThe survival rate of renal tubular epithelial cells was decreased after 24-hour intervention of cadmium chloride (2.5, 5.0, 10.0, 20.0 and 40.0 μmol/L) (allP<0.01), and the survival rate of cells was decreased with the increasing concentrations of cadmium chloride. Using raloxifene (0.05, 0.10, 0.50 and 1.00 μmol/L) to interfere tubular epithelial cells induced by cadmium chloride for 24 h, the survival rate was higher than that of cells induced by cadmium (allP<0.01). The cell morphology of the blank control group was normal, the cell morphology of cadmium chloride group was abnormal and a lot of cells died. Compared with the cadmium chloride group, raloxifene group alleviated. Compared with the blank control group, the expression of 1-α-hydroxylase mRNA of cadmium chloride group was significantly reduced; compared with the cadmium chloride group, the expression of 1-α-hydroxylase mRNA of the raloxifene group was significantly increased (allP<0.05). ConclusionRaloxifene can protect the renal tubular epithelial cells that exposed to cadmium chloride and it can up-regulated the expression of 1-α-hydroxylase mRNA in renal tubular epithelial cells induced by cadmium chloride.

renal tubular epithelial cells; raloxifene; cadmium chloride; cadmium poisoning; renal toxicity; 1-α-hydroxylas; osteoporosis

广西医疗卫生重点科研课题(重2012011)。

潘罅(1990-)，女，在读硕士研究生，主要研究方向为肾脏疾病的基础及临床。E-mail： 401187330@qq.com

简介：尹友生(1957-)，女，教授，硕士研究生导师，研究方向为肾脏疾病的基础及临床。E-mail： yinyousheng@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.002

R155.3

A

1002-266X(2016)30-0005-04

2016-03-09)