兰　钧　阿　萍

西藏自治区食品药品检验所，西藏　拉萨　850000



药物研究

HPLC法测定藏药二十五味珊瑚丸中β-细辛醚的含量

兰钧阿萍

西藏自治区食品药品检验所，西藏拉萨850000

目的：建立藏药二十五味珊瑚丸中β-细辛醚的HPLC含量测定方法。方法：采用Waters XSELECT CSH C18色谱柱，以甲醇-水(56∶44)为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为35℃。结果：β-细辛醚在0.9926～2.9778μg范围内线性良好(r=0.9999)，平均回收率为99.27%，RSD为1.1%。结论：该方法准确、可靠、快速、灵敏，可用于藏药二十五味珊瑚丸的质量控制。

二十五味珊瑚丸；β-细辛醚；高效液相色谱法；含量测定

二十五味珊瑚丸是传统藏药，由珊瑚、珍珠、青金石、珍珠母、诃子、木香、红花、丁香、沉香、朱砂、龙骨等二十五味药材制成，具有清热定惊、开窍通络、止痛的功效，用于治疗“白脉病”，即中枢神经系统疾病，如神志不清，身体麻木，头昏目眩，脑部疼痛，血压不调，头痛，癫痫及各种神经性疼痛[1-2]。首次收载于1995《中国药典》标本版，1997年被国家卫生部批准为国家中药保护品种，目前被《中国药典》2010年版收载。现行检验标准包含简单的化学反应和西红花、红花主要成分的薄层色谱鉴别以及乌头碱的限量测定。涉及的药材少，代表性不足，缺乏组方药材的质控指标及定量标准，难以保证产品质量的稳定和用药安全有效。

二十五味珊瑚丸治疗癫痫等神经性疼痛，藏菖蒲中有效成分β-细辛醚起重要作用，采用UPLC-DAD/Q-TOF-MS对二十五味珊瑚丸全方进行了系统的成分分析，鉴定出6大类61个成分，其中苯丙素类β-细辛醚和α-细辛醚来自藏菖蒲，且二十五味珊瑚丸成药中β-细辛醚含量较高[3-4]。研究表明，β-细辛醚能降低小鼠癫痫发作级别，延长癫痫发作潜伏期，减少湿狗样抖动次数[3,5]。而β-细辛醚是主要入血入脑的成分，既是有效成分，但在高浓度下又是潜在的毒性成分，因此控制β-细辛醚的含量关系到全方的安全性和有效性[4]。本研究拟采用HPLC建立了二十五味珊瑚丸中β-细辛醚的含量测定方法，为藏药二十五味珊瑚丸的质量控制提供参考方法。

1　仪器与材料

1.1仪器Waters高效液相色谱仪(Waters2695泵自动进样器，2998二极管阵列紫外检测器，Waters自带数据处理器)；超声仪；旋转蒸发仪；十万分之一电子天平。

1.2材料β-细辛醚(批号：C10301000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；二十五味珊瑚丸(抽自青海金诃、西藏神猴、昌都光于利民、西藏甘露、西藏藏医学院等9个生产企业，占全国生产企业的73%)。配制阴性样品的药材由西藏自治区食品药品检验所标本室提供。甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)，水为超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Waters Xselect CSH C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇-水(56∶44)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；进样量：10μL。

2.2空白试验按处方中药味比例，配制不含藏菖蒲的群药，按其工艺制成阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备并测定，色谱图见图1。表明阴性样品溶液在与β-细辛醚对照品相同保留时间处未现色谱峰，故认为无干扰。

2.3对照品溶液的制备精密称取β-细辛醚对照品适量，加甲醇制成1mL含0.25mg的溶液，作为对照品溶液。

2.4供试品溶液的制备[4，6，7]取本品2g，研细，精密称定，加甲醇20mL，加热回流提取1h，过滤后，药渣再用20mL甲醇加热回流提取1h。合并两次提取液，用旋转蒸发仪在30℃下减压干燥完全，加入少量甲醇洗涤，用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.5线性关系的考察精密称取β-细辛醚对照品适量，制得浓度溶液为0.24815mg/mL，分别进样2、4、6、8、10、12μl，按上述色谱条件，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程：Y=2.23e+006X-8.85e+004(r=0.9999)，结果表明，β-细辛醚在0.4963～2.9778μg范围内线性关系良好。

2.6精密度试验取同一供试品溶液，连续进样6次，RSD值为 0.5%。表明仪器的精密度良好。

2.7稳定性试验取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别在室温下放置0、2、4、8、12h进样测定，结果峰面积基本不变，RSD值为0.73%，表明供试品溶液在12h内基本稳定。

2.8重复性试验取本品1批，按照上述方法制备成6份供试品溶液，测得β-细辛醚平均含量为2.04mg/g，RSD值为1.1%。

2.9回收率试验精密称取来自7个不同生产企业已知含量的样品约1g，分别精密加入浓度的β-细辛醚对照品，进样测定，平均回收率及RSD值见表1。

表1　回收率试验结果

2.10样品的测定取7个生产企业样品，按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，进行含量测定。计算样品中β-细辛醚的含量，结果见表2。

表27家生产企业样品含量测定数据(n=4)

生产企业批号β-细辛醚(mg·g-1)RSD/%西藏神猴201503070.66060.24西藏藏诺1403040.56470.39西藏光宇利民201302041.24700.56青海金诃201504070.45050.45西藏甘露14125A1.97131.42西藏藏医学院1407010.33431.57西藏金珠雅砻1412020.72381.32

3　讨论

3.1用甲醇、水超声提取，结果杂质峰干扰严重，分离度较差。而采用甲醇加热回流提取后用旋转蒸发仪回收溶剂，可除去较多杂质峰，各组分能够良好分离。

3.2采用不同流动相进行考察，乙腈和0.05%磷酸溶液梯度洗脱，结果出峰时间推迟且峰拖尾，甲醇和水比例为(65∶35)，结果峰分离差。用甲醇和水比例(46∶44)结果峰形对称，分离好且分析时间缩短。

3.3二十五味珊瑚丸中同时含β-细辛醚和α-细辛醚，是藏菖蒲发挥药效的重要指标成分。目前国内无β-细辛醚和α-细辛醚标准品，国外购进的纯度较低[8]，β-细辛醚对照品色谱图显示含β-细辛醚和α-细辛醚两种成分，但是样品中α-细辛醚的含量低，故未建立α-细辛醚的含量测定方法。

3.4由于藏菖蒲药材产地、年限、采收季节等因素不同，β-细辛醚含量明显不同。同时结合78批次样品含量测定结果，考虑该药品存放时间、生产工艺稳定对β-细辛醚含量影响等因素，暂订本品每1g含藏菖蒲以β-细辛醚计，应为0.40～2.20mg。

3.5对全国8家生产企业涉及的78批次的二十五味珊瑚丸进行了β-细辛醚的含量测定，范围在0.30～2.20 mg/g之间，表2可以看出西藏甘露生产(批号：14125A)的二十五味珊瑚丸中β-细辛醚的含量最高，比由西藏藏医学院生产(140701)的高6倍，说明不同生产企业的该药品β-细辛醚含量差异较大，含量较低难以保证药效，故建议现行标准增加β-细辛醚的含量测定以便控制该药品质量。

综上，本实验采用HPLC法对藏药二十五味珊瑚丸的质量进行了评价，并对建立的方法进行了详尽的方法学考察，为二十五味珊瑚丸质量标准的提高提供了实验依据，可作为二十五味珊瑚丸的质量控制方法。

[1]占堆，赵军宁. 藏医成方制剂现代研究与临床应用[M]. 成都：四川科学技术出版社，2009:173-185.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:409-410.

[3]傅思莹，杨国柱，李翎，等.对致痫大鼠氨基酸递质受体及即早基因表达的影响[J].中药材，2014,37(6):1053-1056.

[4]应旭辉.藏药二十五味珊瑚丸化学成分分析及神经保护作用物质基础研究[D].天津：南开大学，2014.

[5]王睿，费洪新，李晓明，等. β-细辛醚通过PKA/CREB信号通路对快速老化痴呆小鼠脑组织凋亡机制的影响[J]. 中国医药导报，2012，9(28)：30-32.

[6]董玉，石任兵，刘斌.石菖蒲有效部位中α-细辛醚、β-细辛醚的含量测定[J]. 北京中医药大学学报，2007,30(5):340-342.

[7]欧小群,罗晓红，江吉村，等.藏药藏菖蒲挥发油成分GC-MS分析[J].成都中医药大学学报，2014,37(3):13-15.

[8]乔立业，岩林苹，汪玥,等.高效液相色谱法测定通塞益脑口服液中α-细辛醚和β-细辛醚的含量 [J].中国医药导报，2015,12(21)：4-7.

(编辑：程鹏飞)

Content Determination of β-asarone in Tibet Traditional Medicine Ershiwuwei Shanhu Pills by HPLC

LAN JunA Ping

Tibet Institute for Food and Drug Control, Lhasa 850000, China

Objective To establish a UPLC determination method for β-asarone in Ershiwuwei Shanhu Pills. Methods The chromatogram column was Waters Xselect CSH C18(4.6mm×250mm,5μm), the mobile phase consisted of methanol-water (20∶80) and the flow rate was 1mL/min. The detection wavelength was 254nm and the column temperature was 35℃. Results The linear range of β-asarone was 0.4963～2.9778μg,r=0.9999. The average recovery rate was 99.27%,RSD%=1.1%. Conclusion The method is accurate, reliable, fast, sensitive, and suitable for quality control of Tibet traditional medicine Ershiwuwei Shanhu Pills.

Ershiwuwei Shanhu Pills; β-Asarone;HPLC;Content Determination

2016-06-15

兰钧(1984-)，女，汉族，本科学历，主管药师，主要从事药品检验和质量标准修订工作。E-mail:623793676@qq.com

R291.408

A

1007-8517(2016)17-0008-03