荣维广， 宋宁慧， 彭凡立， 王春蕾， 朱 峰，阮丽萍， 刘华良， 吉文亮*

(1.江苏省疾病预防控制中心,江苏南京 210009；2.环境保护部南京环境科学研究所,江苏南京 210042；3.东南大学公共卫生学院,江苏南京210009)

食醋是一种常见的调味品，它不仅含有丰富的营养成分且具有独特的药理作用。食醋在生产加工中大部分需要加入焦糖色素，而在生产过程中加入氨(铵)催化剂的焦糖色素的形成过程中容易发生美拉德反应[1]。研究发现，美拉德反应过程中能够产生许多对人体有害的化学物质[2]，如4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)和2-乙酰基-4-(1,2,3,4-四羟基丁基)咪唑(2-Acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl) imidazole，THI)。4-MEI为神经毒素[3]，具有强烈的致惊阙作用，并且美国国家毒品管理计划和其它研究者已经有明确的毒理学数据证明其具有致癌的风险[4 - 8]。2011年，国际肿瘤研究机构(IARC)将甲基咪唑类化合物认定为2B类致癌物[9]，而THI可引起免疫毒性[10 - 12]。因此，建立食醋中4-MEI和THI的检测方法对保证食醋的品质及食用安全尤为重要。

目前，针对食醋中2-MEI和THI的测定尚无文献和标准可查，而可供参考的仅有食品添加剂焦糖色卫生标准(GB 8817-2001)[13],标准中仅规定了焦糖色素中4-MEI含量的测定方法，采用薄层法测定，而对于THI的测定尚无国家标准。近年来，众多分析工作者建立的4-MEI和THI在焦糖色素中的检测方法主要有薄层色谱法[13]、气相色谱法[14 - 16]、液相色谱法[17,18]、离子色谱法[18]、毛细管电泳法[19]、气-质联用技术[20]和液-质联用技术[21,22]，但这些方法普遍需要对样品进行复杂的前处理，分析时间冗长。

高效液相色谱-串联四极杆质谱仪(HPLC-MS/MS) 集合了液相色谱的分离能力和串联四极杆质谱的高灵敏度定量监测能力，已成为定量分析强有力的工具，非常适合快速检测。采用直接进样方式检测食醋中4-MEI和THI，样品经简单稀释、调节pH值，过滤膜后HPLC-MS/MS直接进样测定。此方法简单快速，且不使用有机溶剂，可弥补传统方法的欠缺。本研究建立了采用超纯水对样品进行稀释、调节pH值，HPLC-MS/MS 直接进样测定食醋中4-MEI和THI的方法。该方法灵敏度高、简便、快速和准确，适合大批量食醋中4-MEI和THI的检测及确证分析。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Accela高效液相色谱仪，TSQ Quantum Access Max串联质谱仪(配电喷雾离子源)(美国，Thermo Fisher公司)；涡旋快速混合器(姜堰市新康医疗器械有限公司)；纯水仪(美国，Millipore)。

4-MEI和THI标准品均购自西格玛公司，纯度均≥99.0%；d6-4-甲基咪唑(d6-4-methylimidazole，d6-4-MEI)购自加拿大C/D/N公司，纯度≥99.0%。甲醇、乙腈为色谱纯(Merck)；氨水为优级纯(含量25%～28%，南京化学试剂有限公司)；水系微孔滤膜(0.22 μm，南京荣华科学器材有限公司)；超纯水。

1.2 标准品和标准溶液的制备

分别称取4-MEI、THI和d6-4-MEI标准品0.0125 g(精确至0.1 mg)，用超纯水分别溶解定容至 25 mL，分别配制成0.5 g/L的标准储备液。根据使用需要用水逐级稀释成适当浓度的中间溶液和标准使用溶液。均置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 样品前处理

1.3.1白醋和米醋吸取样品1 mL，加超纯水稀释定容至20 mL，涡旋混匀后经1 mol/L氨水溶液调节pH=9左右，静置5 min，采用0.22 μm水系微孔滤膜过滤，滤液收集到1.5 mL进样小瓶中，待检测。

1.3.2香醋和陈醋吸取样品1 mL，加超纯水稀释定容至50 mL，其它操作同1.3.1。

1.4 液相色谱和串联质谱条件

1.4.1液相色谱条件色谱柱：Polaris C18-A柱 (150×4.6 mm,3 μm)；流动相： A 为乙腈，B 为0.05%氨水溶液；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～5 min，5%A；5～10 min，5% ～40%A；10～10.1 min，5%A；10.1～12 min，5%A。柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.4.2串联质谱条件电离方式：ESI+；离子喷雾电压：正离子4 000 V；挥发气温度：400 ℃；毛细管温度：270 ℃；鞘气：60 Arb；辅助气：15 Arb；碰撞气：氩气；扫描模式：多反应监测(Multiple Reaction Monitoring，MRM)。参数详见表1。

表1 多反应监测参数

2 结果与讨论

2.1 流速的优化

流速不仅会影响出峰时间、色谱峰的峰形，同时也会影响目标物与基质的分离情况。实验比较了0.3 mL/min、0.4 mL/min和0.5 mL/min流速情况下对峰形及分离的影响，结果在0.4 mL/min条件下峰形较好，并且待测物THI与基质分离较好，定量更准确。

2.2 进样溶液pH值和取样量的优化

目标化合物在深色醋和浅色醋中属于痕量物质，若采用传统萃取方法，重现性差，成本高，且会使用大量有机溶剂。本研究采用直接进样方式进行分析，但为减少基质效应对测定的影响，还需对样品进行稀释处理。选取若干主流品牌的深色的香醋和陈醋分别稀释 10～100 倍进行检测，发现在较低稀释倍数下，随着稀释倍数的增加，基质干扰逐渐减小，响应值增加，当稀释倍数为 20～50倍时，信噪比达到最佳，继续增大稀释倍数，响应值降低。本文最终选择深色的香醋和陈醋的稀释倍数为 50 倍。同样方法确定浅色的白醋和米醋最佳稀释倍数为 20 倍。

本研究采用直接进样方式进行分析，由于样品醋的pH值较低，进样溶液pH值将影响目标化合物4-MEI 和THI的峰形和保留时间，因此有必要对进样溶液调节pH值。分别将进样溶液用氨水将pH值调节到7.0、8.0和9.0，静置5 min后过0.22 μm水系微孔滤膜进样，当pH为9.0时，无论是峰形、保留时间和峰面积均能稳定的重现。经验证，将pH调到9.0对于深色的香醋、陈醋和浅色的白醋、米醋同样适用。

2.3 方法评价

2.3.1方法的标准曲线、相关系数及线性范围将混合标准工作液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L，在选定的条件下测定，得到4-MEI和THI的线性方程、相关系数和线性范围。在0.01～1.0 mg/L 线性范围内，4-MEI和THI均表现出良好的线性关系，线性方程分别为：Y=0.0601+0.0213X和Y=-0.0967+0.0164X，相关系数均大于0.9991。图1为4-MEI和THI标准品的多反应监测色谱图，图2为典型陈醋样品中4-MEI和THI添加回收多反应监测色谱图。

本研究根据3倍信噪比(S/N=3)得到4-MEI和THI的最低检出浓度为0.003 mg/L。当浅色的白醋和米醋取样为1 mL，经本研究确定的前处理方法处理后最终定容到20 mL检测分析，得到4-MEI和THI的检出限(LOD)均为0.06 mg/L，根据10 倍信噪比(S/N=10)得到定量限(LOQ)均为0.2 mg/L。深色的香醋和陈醋取样为1 mL，经本研究确定的前处理方法处理后最终定容到50 mL检测分析，得到4-MEI 和THI的LOD均为0.15 mg/L，LOQ均为0.5 mg/L。

2.3.2方法的准确度和精密度本方法分别选取深色和浅色的醋的代表性样品，设置0.2 mg/L、0.5 mg/L和2.0 mg/L三个加标水平进行加标回收率实验，重复测定6次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。4-MEI的平均回收率为91.5%～101.4%，THI的平均回收率为80.2%～87.2%，准确度均较好，RSD均小于6.4%，见表2。

表2 加标样品的回收率及相对标准偏差(n=6)

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2.4 实际样品的测定

对从市场上购买的18份食醋样品进行了检测(白醋、米醋、香醋和陈醋的份数分别为3、3、6和6份)，每个样品重复测定3次，结果见表3。全部样品均未检出THI；所有白醋和米醋均未检出4-MEI；部分香醋和陈醋4-MEI有检出。

表3 样品醋中4-MEI和THI含量(n=3)

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3 结论

本文建立了超高效液相色谱-电喷雾串联质谱直接测定食醋中 4-MEI和THI 含量的快速测定和确证方法。应用本方法可在 20 min 内完成整个检测分析过程，分析效率很高。样品经超纯水稀释后调节pH值后直接进样测定，在选定的色谱，质谱条件下，基质对目标物测定基本无干扰，避免了传统方法中复杂的萃取、净化等前处理过程。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，能够满足食醋中4-MEI和THI 的分析要求，适合大批量食醋样品中 4-MEI和THI 的定性和定量分析。